本文關(guān)鍵詞：人自噬相關(guān)基因LC3B原核表達載體的構(gòu)建及活性檢測

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【摘要】：目的構(gòu)建帶GST標簽的人LC3B基因原核表達載體,得到GST-LC3B重組質(zhì)粒并純化出GST-LC3B融合蛋白,體外檢測并證實該蛋白的生物學活性。方法利用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中擴增出LC3B基因的編碼序列,將該序列插入到p GEX-KG載體中,得到GST-LC3B重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rossate,經(jīng)小量誘導后利用GSTSepharose 4B親和珠純化GST-LC3B融合蛋白,通過SDS-PAGE電泳和Western印跡方法進行檢測,GST pull-down技術(shù)證實其生物學活性。結(jié)果利用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中成功擴增得到大小約400 bp的目的基因片段,插入p GEX-KG載體中得到GST-LC3B質(zhì)粒,經(jīng)雙酶切鑒定及測序結(jié)果表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功;轉(zhuǎn)化Rossate菌并小量誘導,表達鑒定成功后純化得到相對分子質(zhì)量(Mr)約為40×103的目的蛋白;GST pull-down技術(shù)檢測出GST-LC3B融合蛋白可以和Atg4B蛋白在體外作用,具有較好的生物學活性。結(jié)論成功構(gòu)建了人自噬相關(guān)基因LC3B的原核表達產(chǎn)物,為進一步研究LC3B在自噬中的作用機制奠定了基礎。
【作者單位】： 解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院;軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所;
【關(guān)鍵詞】： 人LCB基因 原核表達 純化 自噬
【基金】：國家自然科學基金資助項目(31100604)
【分類號】：R392.12;Q78
【正文快照】： 自噬(autophagy)是真核生物細胞特有的一種自我降解、自我吞噬的生命現(xiàn)象[1]。自噬的實質(zhì)是細胞的分解代謝[2],即在營養(yǎng)缺失、低氧或病原體感染等應激條件下,細胞依賴溶酶體對自身的大分子物質(zhì)(如蛋白)、細胞器(如線粒體)等進行降解,以提供細胞生存代謝所需的能量和營養(yǎng)物質(zhì)。

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本文編號：1070234