本文關鍵詞：組蛋白乙酰轉移酶MOF在細胞應激中的調(diào)控作用

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【摘要】：細胞受到損害因素刺激(如基因毒性劑、高溫、缺氧、活性氧增多、細菌或病毒感染等)時,會產(chǎn)生一系列防御或適應性反應,這些反應統(tǒng)稱為細胞應激(Cellular Stress),細胞應激反應的最終目的是通過誘導一些基因表達的改變,使細胞對有害環(huán)境的抵抗能力或耐受性增加,得以在惡劣環(huán)境下存活。熱休克蛋白(Heat Shock Proteins, HSPs)是細胞應激反應中參與細胞保護作用的主要應激蛋白,HSPs是一類細胞在高溫(熱休克)或其他應激原作用下所誘導生成或生成增加的蛋白質(zhì),這類蛋白廣泛存在于各種細胞中并且高度保守。正常狀態(tài)下,HSPs在細胞內(nèi)也有表達,只是水平較低,負責維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定狀態(tài)。除了高溫,其他的許多生物、化學及物理因素如：自由基、活性氧、炎性因子、射線等也會誘導HSPs表達量增高。HSPs的表達則是由細胞中一類叫熱休克因子(Heat Shock Factors,HSFs)的小家族轉錄因子誘導的,HSFs與HSP基因的5’端啟動子區(qū)的熱休克應答元件(heat shock elements,HSEs)相互結合激活HSP基因的轉錄。HSFs家族由四個成員組成,包括HSF1、HSF2、HSF3和HSF4,其中HSF1是哺乳動物細胞中HSPs的主要轉錄調(diào)控因子。正常生理狀態(tài)下,HSF1以單體形式與分子伴侶及共伴侶分子形成復合物呈現(xiàn)無活性的抑制狀態(tài),當各種應激因素刺激細胞時,HSF1從復合物中釋放,經(jīng)過一系列翻譯后修飾,獲得轉錄活性,并在細胞核內(nèi)積累聚集,結合到熱休克應答元件上,激活HSP基因的轉錄,誘導HSPs蛋白表達增加。MOF(也叫作KAT8或MYST1)是組蛋白乙�；D移酶MYST家族的成員,可以特異地乙酰化組蛋白H4的第16位賴氨酸殘基(H4K16ac),是胚胎發(fā)育及轉錄激活重要的調(diào)控因子。MOF在細胞的諸多生理活動過程中發(fā)揮著至關重要的作用,包括細胞增殖、分化、腫瘤發(fā)生及DNA損傷應答修復等。有研究表明,MOF可以直接結合到細胞周期調(diào)控所需基因的啟動子激活它們的表達,細胞應激狀態(tài)下,MOF是細胞應激響應轉錄調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵維持因子。因此,研究MOF與HSF1及HSPs在細胞應激中的關系及相互作用,有助于我們更深入的了解細胞應激響應機制。研究目的：利用紫外線交聯(lián)儀照射細胞,基因毒性劑放線菌素D(ActD)、絲裂霉素C(MMC)處理細胞及42℃水浴熱激細胞,建立細胞應激損傷模型,通過蛋白質(zhì)印跡、細胞漿與細胞核蛋白抽提,細胞的免疫熒光染色,免疫沉淀等分子生物學、細胞生物學等檢測方法,觀察應激組與對照組相比MOF、HSF1、HSP90蛋白表達水平的變化,細胞內(nèi)的定位及它們之間的相互作用關系,從而確定它們在細胞應激反應中的作用。研究方法：1.培養(yǎng)人乳腺癌MCF7細胞、結腸癌HCT116細胞、宮頸癌HeLa細胞,分為對照組和處理組,處理組進行相應的應激損傷處理；于相應的時間收集對照組和應激處理組細胞,收細胞之前觀察一下細胞形態(tài)的變化；2.WesternBlotting檢測MOF蛋白表達及H4K16ac水平,比較對照組及應激處理組MOF蛋白表達的變化及細胞形態(tài)的變化,從而確定MOF對處于應激狀態(tài)下細胞的作用；3.干擾MOF表達,進行應激損傷處理,檢測敲低MOF的細胞與正常細胞相比,細胞應激時細胞形態(tài)變化；4.在MCF7細胞中過表達MOF, MTT法檢測細胞應激損傷處理后,與對照組相比,過表達MOF的細胞存活率的變化,進一步明確MOF在細胞應激響應中的作用；5.細胞漿蛋白與細胞核蛋白抽提與分離,檢測MOF在細胞內(nèi)的亞細胞定位及是否在細胞質(zhì)與細胞核之間進行穿梭；6.細胞免疫熒光檢測MOF、HSF1及HSP90的亞細胞定位及變化；7.Co-IP檢測非應激狀態(tài)及應激狀態(tài)下MOF、HSF1、HSP90之間相互作用關系；7.用siRNA干擾的方法,干擾MOF的表達,然后用細胞免疫熒光染色檢測敲低MOF時,與MOF正常表達的細胞相比,應激狀態(tài)下HSF1及HSP90在細胞內(nèi)的蛋白表達及亞細胞定位。實驗結果：1. WesternBlotting結果顯示發(fā)生細胞應激反應過程中,MOF蛋白表達水平升高,H4K16ac水平變化變化趨勢與之相似,表明細胞應激損傷時,MOF會參與到損傷修復當中,損傷后期,MOF蛋白及H4K16ac水平降低,恢復到接近正常水平,同時在顯微鏡下觀察到大量細胞死亡,并且敲低MOF的細胞與正常細胞相比死亡更為嚴重；2.MTT檢測結果：過表達MOF的細胞與正常細胞相比,細胞應激反應后期存活率較高,進一步證實MOF參與到細胞應激反應過程中,過表達MOF可以增強細胞對應激損傷的的抵抗能力；3.細胞漿與細胞核蛋白抽提與分離結果表明,細胞應激時,MOF始終定位在細胞核中,并沒有進行核質(zhì)穿梭；4.細胞免疫熒光實驗顯示,細胞應激時,MOF會在細胞核內(nèi)聚集,形成的核結構與熱休克反應時HSF1形成的應激小體形態(tài)規(guī)則相似；5.HSF1與MOF或HSP90與MOF兩種抗體進行細胞免疫熒光染色亞細胞定位,顯示細胞應激時MOF、HSF1及HSP90會在核內(nèi)聚集形成共定位的應激小體；6.Co-IP結果顯示應激狀態(tài)和正常生理情況下MOF與HSF1及HSP90之間都存在相互作用,而HSF1和HSP90只有在正常狀態(tài)存在相互作用。7.敲低MOF不影響HSF1與HSP90蛋白水平,但會破壞細胞應激時它們在核內(nèi)的聚集形成核應激小體。結論：MOF是應激反應中轉錄調(diào)控的重要調(diào)節(jié)因子,HSF1是核應激小體的標記并且可以轉錄激活參與細胞應激應答的基因,我們的研究結果證實MOF始終定位在細胞核內(nèi)并且與HSF1及HSP90存在相互作用,細胞應激時MOF會協(xié)同HSF1和HSP90一起,聚集形成應激小體,參與應激響應、修復損傷。我們的研究有助于進一步理解細胞應激響應過程,深入闡明細胞損傷修復機制。
【關鍵詞】：細胞應激 MOF HSF1 HSP90 核應激小體
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R329.2
【目錄】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 符號說明13-15
• 前言15-24
• 材料與方法24-33
• 實驗方法33-43
• 實驗結果43-53
• 討論53-56
• 實驗結論56-57
• 參考文獻57-61
• 致謝61-62
• 發(fā)表學術論文62
• 參與研究課題62-63
• 附件63

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本文編號：1067765