本文關(guān)鍵詞：抗TRPC3多肽單克隆抗體制備及其初步應(yīng)用

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【摘要】：1研究目的與意義瞬時(shí)受體電位陽離子通道3亞型(Transient receptor potential channel 3,TRPC3)是一種非選擇性、非電壓控制的陽離子通道,其主要功能是調(diào)控Ca2+、Na+等進(jìn)出細(xì)胞,以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。本實(shí)驗(yàn)主要目的是制備抗TRPC3多肽單克隆抗體(Monoclonal antibody,Mc Ab),并初步建立雙抗體夾心ELISA檢測(cè)法擬對(duì)TRPC3分子表達(dá)進(jìn)行應(yīng)用。研究意義在于所制備的抗TRPC3多肽單克隆抗體國(guó)內(nèi)外未見銷售,且這個(gè)單克隆抗體能廣泛應(yīng)用于免疫標(biāo)記技術(shù),可用于各種TRPC3蛋白表達(dá)的相關(guān)研究。采用已建立的檢測(cè)方法可以測(cè)定與TRPC3蛋白相關(guān)疾病如動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,As)、高血壓等疾病的輔助診斷。2研究的主要內(nèi)容、方法和結(jié)果2.1 TRPC3多肽抗原的設(shè)計(jì)與合成利用生物信息學(xué)方法分析TRPC3的跨膜結(jié)構(gòu)、胞外區(qū)域,獲得三段線性胞外序列391-418、473-523以及589-637,再根據(jù)B細(xì)胞抗原表位篩選原則,篩選出TRPC3分子的優(yōu)勢(shì)表位肽段509YFTYARDKWLPSDPQ 523。該段序列由15個(gè)氨基酸組成,其在抗原指數(shù)、親水性、柔韌性及二級(jí)結(jié)構(gòu)分析上均相對(duì)其他肽段好。合成的多肽純度98%,在與鑰孔嘁藍(lán)蛋白(Keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶聯(lián)后,作為免疫小鼠的免疫原。2.2制備抗TRPC3多肽單克隆抗體用制備的多肽抗原免疫Balb/c小鼠,三次免疫后,測(cè)定小鼠血清免疫效價(jià)。1號(hào)小鼠血清效價(jià)最高,達(dá)1:2×104,對(duì)1號(hào)小鼠加強(qiáng)免疫后可取脾臟細(xì)胞進(jìn)行下一步融合。用聚乙二醇使小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合,用HAT、HT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細(xì)胞。利用間接ELISA檢測(cè)克隆生長(zhǎng)孔上清液的抗體,篩選陽性細(xì)胞克隆。經(jīng)過四次有限稀釋克隆化后,得到八株100%分泌抗TRPC3多肽抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞,分別為A5、B8、B10、C6、F6、G11、H7和H9。在此基礎(chǔ)上反復(fù)檢測(cè),最終獲得三株穩(wěn)定分泌抗TRPC3多肽抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞,分別命名為T1、T2、T3。三株小鼠腹水液超濾濃縮后濃度T1為1.884mg/ml,T2為1.787mg/ml,T3為1.648mg/ml。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分析,三株超濾濃縮后的腹水液在55KD和25KD處均有清晰條帶,分別是單克隆抗體的重鏈與輕鏈。2.3雙抗體夾心ELISA法建立及在臨床檢測(cè)的應(yīng)用由相對(duì)親和力實(shí)驗(yàn)測(cè)定,T1抗體的相對(duì)親和力最高,為8.255×10-3μg/ml。采用競(jìng)爭(zhēng)ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定單抗的敏感性,T1的IC50為10μg/ml,T2的IC50為1.3μg/ml,T3的IC50為2.6μg/ml,敏感度從高到低依次為:T2T3T1,T2的敏感度最高。在相對(duì)親和力測(cè)定基礎(chǔ)上,進(jìn)行配對(duì)實(shí)驗(yàn),獲得T3+T1配對(duì)組合為最佳配對(duì)方案,當(dāng)包被抗體T3的濃度為0.842μg/ml,配對(duì)抗體T1的濃度為0.235μg/ml時(shí)為其最佳工作濃度。建立的雙抗夾心ELISA法的敏感范圍為0.681-8μg/ml,靈敏度為0.681μg/ml。采用所建立的雙抗體ELISA測(cè)定體系對(duì)AS相關(guān)疾病的血清樣本進(jìn)行TRPC3含量檢測(cè),初步證實(shí)各病人組高于正常人的值。3結(jié)論3.1在確定TRPC3分子的胞外五段序列基礎(chǔ)上,通過比對(duì)同源性、不同序列的抗原指數(shù)、親水性、柔韌性、二級(jí)結(jié)構(gòu)等性質(zhì)的分析,最終決定將509YFTYARDKWLPSDPQ523氨基酸序列作為TRPC3多肽抗原的合成序列,合成TRPC3多肽純度大于98%,合成的多肽抗原與KLH偶聯(lián)后可作為免疫小鼠的免疫抗原。3.2小鼠免疫后,獲得了抗TRPC3多肽多克隆抗體,多抗效價(jià)為1:2×104;經(jīng)過細(xì)胞融合、篩選和超濾濃縮等過程,建立了T1、T2、T3三株雜交瘤細(xì)胞系,獲得了抗TRPC3多肽單克隆抗體,其效價(jià)為1:8×104,為單抗的應(yīng)用提供物質(zhì)基礎(chǔ)。3.3通過相對(duì)親和力及抗原表位分析,確定了包被T3+T1抗體,作為最佳配對(duì)方案。當(dāng)包被抗體T3的濃度為0.842μg/ml,配對(duì)抗體T1的濃度為0.235μg/ml時(shí)為配對(duì)抗體的最佳工作濃度,并初步建立了的雙抗體夾心ELISA體系,運(yùn)用到臨床樣本的檢測(cè)當(dāng)中。
【關(guān)鍵詞】：TRPC3 多肽 單克隆抗體 ELISA 應(yīng)用
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R392.11
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 引言8-9
• 第一部分 研究背景和立題依據(jù)9-18
• 研究背景 TRPC3在疾病中作用的研究進(jìn)展9-15
• 1 TRPC3分子簡(jiǎn)介9-11
• 2 TRPC3與疾病11-12
• 3 展望12
• 參考文獻(xiàn)12-15
• 立題依據(jù)與研究?jī)?nèi)容15-18
• 1 立題依據(jù)15-16
• 2 研究?jī)?nèi)容16-17
• 3 技術(shù)路線17-18
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究18-60
• 第一章 TRPC3多肽B細(xì)胞抗原表位篩選18-27
• 1 材料與方法18-19
• 2 結(jié)果19-24
• 3 討論24-25
• 參考文獻(xiàn)25-27
• 第二章 抗TRPC3多肽單克隆抗體制備與鑒定27-49
• 第一節(jié) TRPC3多肽小鼠免疫及血清檢測(cè)27-32
• 第二節(jié) 細(xì)胞融合、篩選及建立雜交瘤細(xì)胞株32-40
• 第三節(jié) 單克隆抗體的擴(kuò)大化制備、濃縮和鑒定40-48
• 參考文獻(xiàn)48-49
• 第三章 雙抗體夾心ELISA體系的建立及其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用49-60
• 第一節(jié) 單克隆抗體相對(duì)親和力測(cè)定49-53
• 第二節(jié) 雙抗體夾心ELISA法的建立及其在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用53-59
• 參考文獻(xiàn)59-60
• 結(jié)論與展望60-61
• 附錄 英文縮寫61-62
• 碩士期間研究成果62-63
• 致謝63

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