本文關(guān)鍵詞：電壓門控鈣通道對(duì)衰老動(dòng)物模型中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響

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【摘要】：衰老性骨質(zhì)疏松癥是一類具有特定病理生理特點(diǎn)的老年性綜合癥:在增齡的影響下,生物體內(nèi)骨小梁數(shù)量減少,骨質(zhì)強(qiáng)度降低,骨量下降。衰老性骨質(zhì)疏松癥所導(dǎo)致的并發(fā)癥如疼痛、骨折、呼吸困難等常常給患者帶來(lái)很多困擾。伴隨著全球老齡化的逐漸加劇,衰老性骨質(zhì)疏松癥的防治形勢(shì)也日益嚴(yán)峻。對(duì)衰老的研究通常建立在衰老動(dòng)物模型上,將小鼠金屬蛋白酶24基因敲除(KO)會(huì)導(dǎo)致其產(chǎn)生早老的癥狀,因此這種小鼠是研究衰老的一個(gè)較為成熟的動(dòng)物模型。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨系細(xì)胞中的多能干細(xì)胞,其在骨骼代謝的過(guò)程中扮演了重要的角色。它具有多向分化的功能,使得新骨能夠替換舊骨,進(jìn)而能夠維持骨組織自我更新的能力,是當(dāng)前組織工程研究中的一大熱點(diǎn)。然而,伴隨著年齡的增加,BMMSCs的自我更新、多向分化等一系列生物學(xué)功能是否受到衰老影響產(chǎn)生障礙,其發(fā)展變化的內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)控制了BMMSCs的成骨分化過(guò)程,鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尤其是L型電壓門控鈣通道與BMMSCs成骨分化關(guān)系密切。然而L型鈣通道是否通過(guò)調(diào)節(jié)BMMSCs成骨分化導(dǎo)致衰老性骨質(zhì)疏松的發(fā)生,尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此我們?cè)O(shè)計(jì)本實(shí)驗(yàn)來(lái)探索衰老小鼠BMMSCs鈣信號(hào)通路的變化以及其對(duì)bmmscs成骨分化的影響,以期進(jìn)一步揭開(kāi)衰老性骨質(zhì)疏松中bmmscs缺陷的內(nèi)在機(jī)理。實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.研究早衰小鼠骨量較野生小鼠的變化。2.研究早衰小鼠bmmscs成骨分化能力較野生小鼠的變化。3.研究早衰小鼠bmmscs鈣信號(hào)較野生小鼠的變化。4.通過(guò)正負(fù)向調(diào)節(jié)l型電壓門控鈣通道探討其對(duì)早衰小鼠bmmscs成骨分化能力的影響。實(shí)驗(yàn)方法1.分別取早衰轉(zhuǎn)基因(zmpste24-/-)小鼠和野生型(wt)小鼠各3只,用micro-ct以360°、10μm的掃描分辨率對(duì)各小鼠的肱骨近端進(jìn)行掃描,選擇目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行骨小梁三維圖像重建,比較分析ko小鼠和wt小鼠骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁數(shù)量以及骨密度的差異。2.取ko小鼠和wt小鼠各6只,脫頸處死后,貼壁法制取bmmscs原代,傳至p3代,成骨分化誘導(dǎo)14天,分別用茜素紅染色的方法觀察ko小鼠和wt小鼠bmmscs礦化結(jié)節(jié)形成情況;用rt-pcr技術(shù)檢測(cè)ko小鼠和wt小鼠bmmscs成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)水平;用westernblot技術(shù)檢測(cè)ko小鼠和wt小鼠bmmscs成骨相關(guān)因子的蛋白水平。3.用激光掃描共聚焦熒光顯微鏡檢測(cè)ko小鼠和wt小鼠p3代bmmscs胞內(nèi)鈣離子的濃度差異;用rt-pcr技術(shù)檢測(cè)ko小鼠和wt小鼠bmmscs內(nèi)電壓門控鈣離子通道的表達(dá)特點(diǎn),篩選出有差異的鈣離子通道。4.在發(fā)現(xiàn)ko小鼠bmmscs表達(dá)鈣離子通道cav1.2低于wt小鼠的基礎(chǔ)上,以成骨誘導(dǎo)液加cav1.2鈣通道抑制劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的wt小鼠bmmscs為實(shí)驗(yàn)組,以成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的wt小鼠bmmscs為對(duì)照組。檢測(cè)鈣通道抑制劑對(duì)wt小鼠bmmscs成骨分化的影響;以過(guò)表達(dá)cav1.2鈣通道的ko小鼠bmmscs為實(shí)驗(yàn)組,無(wú)特殊處理的ko小鼠bmmscs為對(duì)照組,成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)14天后,檢測(cè)過(guò)表達(dá)cav1.2對(duì)ko小鼠bmmscs成骨分化能力的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1ko小鼠和wt小鼠通過(guò)micro-ct檢測(cè)發(fā)現(xiàn):ko小鼠的肱骨干骺端骨質(zhì)較wt小鼠稀疏。ko小鼠的骨體積分?jǐn)?shù)(bv/tv)、骨小梁數(shù)量(tb.n)、骨密度(bmd)均低于wt小鼠,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(p0.05)。2ko小鼠和wt小鼠的bmmscs經(jīng)純化培養(yǎng)后均呈細(xì)長(zhǎng)多邊形,且可貼壁生長(zhǎng);茜素紅染色可見(jiàn)兩種小鼠的bmmscs均有礦化結(jié)節(jié)形成;半定量分析結(jié)果顯示ko小鼠的染色陽(yáng)性顆粒數(shù)明顯低于wt小鼠(p0.05);rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,ko小鼠bmmscs中成骨相關(guān)基因alp、runx2、opnmrna的表達(dá)水平明顯低于wt小鼠(p0.05);westernblot結(jié)果顯示,ko小鼠bmmscs中成骨相關(guān)因子alp、runx2、opn的蛋白表達(dá)水平亦均明顯低于wt小鼠(p0.05)。3激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示,ko組bmmscs的鈣熒光強(qiáng)度低于wt組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,(p0.05);rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,ko組bmmscs中鈣離子通道cav1.1、1.2、2.1、2.2的表達(dá)水平均明顯低于wt組(p0.05)。4茜素紅染色結(jié)果可見(jiàn)wt小鼠cav1.2抑制組bmmscs礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性顆粒數(shù)量明顯低于對(duì)照組(p0.05);rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,cav1.2抑制組bmmscs中成骨相關(guān)基因runx2、opn的表達(dá)水平亦均明顯低于對(duì)照組,(p0.05);westernblot結(jié)果顯示,cav1.2抑制組bmmscs中成骨相關(guān)因子runx2、opn的蛋白表達(dá)水平亦均明顯低于對(duì)照組(p0.05)。對(duì)ko小鼠bmmscs成功轉(zhuǎn)染cav1.2后誘導(dǎo)其成骨分化,茜素紅染色結(jié)果可見(jiàn)ko小鼠cav1.2過(guò)表達(dá)組bmmscs礦化結(jié)節(jié)染色陽(yáng)性顆粒數(shù)明顯多于對(duì)照組,(p0.05);rt-pcr檢測(cè)結(jié)果顯示,cav1.2過(guò)表達(dá)組bmmscs中成骨相關(guān)基因runx2、opn的表達(dá)水平亦均明顯高于對(duì)照組(p0.05);westernblot結(jié)果顯示,cav1.2過(guò)表達(dá)組bmmscs中成骨相關(guān)因子runx2、opn的蛋白表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(p0.05)。結(jié)論1.與wt小鼠相比,ko小鼠存在骨骼衰老的癥狀,表現(xiàn)為骨小梁數(shù)量、骨體積分?jǐn)?shù)以及骨密度的下降;2.與wt小鼠bmmscs相比,ko小鼠bmmscs生物學(xué)性能發(fā)生了改變,表現(xiàn)為成骨分化能力的降低;3.KO小鼠BMMSCs的鈣信號(hào)通路發(fā)生了改變,表現(xiàn)為胞內(nèi)鈣離子濃度下降以及Cav1.2鈣通道表達(dá)減少;4.通過(guò)抑制Cav1.2和過(guò)表達(dá)Cav1.2,我們推測(cè)KO小鼠BMMSCs低表達(dá)L型電壓門控鈣離子通道Cav1.2導(dǎo)致其成骨分化能力下降。
【關(guān)鍵詞】：電壓門控鈣通道 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 骨質(zhì)疏松 早老癥
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R-332;R580
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-26
• 一、衰老性骨質(zhì)疏松癥與衰老模型17-19
• 二、衰老性骨質(zhì)疏松與BMMSCs的關(guān)系19-21
• 三、調(diào)節(jié)控制BMMSCs成骨分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路21-25
• 四、假說(shuō)與研究背景25-26
• 實(shí)驗(yàn)一 金屬蛋白酶24敲除（zmpste24~(-/-)）小鼠骨質(zhì)特征的研究26-29
• 1 前言26
• 2 實(shí)驗(yàn)材料26
• 3 實(shí)驗(yàn)方法26-27
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-28
• 5 討論28-29
• 實(shí)驗(yàn)二 Zmpste24KO小鼠和WT小鼠BMMSCs的培養(yǎng)和鑒定以及二者成骨分化能力的比較29-43
• 1 前言29
• 2 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 3 實(shí)驗(yàn)方法31-38
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果38-41
• 5 討論41-43
• 實(shí)驗(yàn)三 Zmpste24KO小鼠與WT小鼠BMMSCs胞內(nèi)鈣離子濃度差異以及電壓門控鈣通道的表達(dá)檢測(cè)43-48
• 1 前言43
• 2 實(shí)驗(yàn)材料43-44
• 3 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-46
• 5 討論46-48
• 實(shí)驗(yàn)四 檢測(cè)Cav1.2 對(duì)小鼠BMMSCs成骨分化能力的影響48-60
• 1 前言48
• 2 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 3 實(shí)驗(yàn)方法49-54
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果54-58
• 5 討論58-60
• 小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-67
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果67-68
• 致謝68

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本文編號(hào)：1027129