發(fā)布時(shí)間：2023-02-26 16:13

　　目的:克隆人腸道病毒71型(EV71)及柯薩奇病毒A組16型(CA16)的VP1蛋白編碼基因,構(gòu)建相應(yīng)真核表達(dá)質(zhì)粒在體外進(jìn)行重組表達(dá),檢測(cè)其細(xì)胞內(nèi)定位,為EV71及CA16的疫苗研究提供基礎(chǔ)。方法:通過PCR擴(kuò)增分別獲取EV71及CA16的VP1編碼序列,插入pcFlag載體,分別構(gòu)建EV71及CA16 VP1與FLAG標(biāo)簽融合的真核表達(dá)質(zhì)粒;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人胚腎293T細(xì)胞及橫紋肌肉瘤RD細(xì)胞,Western blot法檢測(cè)融合蛋白的表達(dá),免疫熒光檢測(cè)融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況。結(jié)果:測(cè)序表明兩種來(lái)源VP1蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確;分別轉(zhuǎn)染兩種不同的細(xì)胞后,均可通過Western blot檢測(cè)到相應(yīng)蛋白表達(dá);免疫熒光檢測(cè)顯示兩種毒株的VP1均表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)論:外源融合表達(dá)EV71或CA16 VP1蛋白的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功;所構(gòu)建質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,均可在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)檢測(cè)到VP1融合蛋白的表達(dá)。

【文章頁(yè)數(shù)】：5 頁(yè)

【文章目錄】：
1 材料與方法
    1.1 材料與試劑
    1.2 病毒RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄
    1.3 目的片段獲取
    1.4 重組載體構(gòu)建與鑒定
    1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
    1.6 Western blot檢測(cè)外源蛋白表達(dá)
    1.7 免疫熒光檢測(cè)外源蛋白細(xì)胞內(nèi)定位
2 結(jié)果
    2.1 CA16和EV71毒株VP1片段的擴(kuò)增
    2.2 CA16和EV71毒株VP1片段及真核表達(dá)載體pcFlag的酶切回收與連接
    2.3 含有CA16和EV71毒株VP1的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建和鑒定
    2.4 VP1蛋白在細(xì)胞中的外源重組表達(dá)
    2.5 重組VP1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位
3 討論



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