本文關鍵詞：SDH2基因在白念珠菌致病性中的作用及其機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白念珠菌是一種常見的人類致病真菌。它在侵襲宿主的過程中可以進行酵母態(tài)-菌絲態(tài)的形態(tài)轉換,該形態(tài)轉換也是白念珠菌致病機制研究的重點。本課題前期研究利用線蟲模型篩選白念珠菌基因突變菌庫,試圖發(fā)現(xiàn)影響致病力的關鍵因子,研究發(fā)現(xiàn)白念珠菌SDH2基因突變菌在線蟲模型上致病力完全喪失且菌絲形成能力產(chǎn)生缺陷,具有研究價值。SDH2基因參與編碼的蛋白同時在三羧酸(Tricarboxylic acid,TCA)循環(huán)和線粒體電子傳遞鏈(Electron transport chain,ETC)中發(fā)揮功能,在TCA循環(huán)中是琥珀酸脫氫酶(Succinate dehydrogenase,SDH),同時還是線粒體電子傳遞鏈的復合體II,是有氧呼吸過程中發(fā)揮重要作用的酶。我們前期以野生型白念珠菌SC5314為親本菌,利用SAT-flipper方法重新構建了SDH2缺失菌sdh2Δ/Δ。該基因敲除方法的優(yōu)勢在于利用諾爾絲菌素(Nourseothricin)抗性標記篩選陽性克隆,諾爾絲菌素抗性標志基因可在后續(xù)實驗中被完整剔除,避免營養(yǎng)缺陷標志基因對致病力的干擾。在線蟲模型和小鼠模型上,sdh2Δ/Δ致病力顯著降低并且菌絲形成能力缺陷。在體外實驗中,我們發(fā)現(xiàn)sdh2Δ/Δ在不同是菌絲誘導培養(yǎng)基上都顯示出菌絲形成能力缺陷,且利用非發(fā)酵碳源障礙。但值得注意的是,在含可發(fā)酵碳源葡萄糖的菌絲誘導培養(yǎng)基上,sdh2Δ/Δ依然不能形成正常的菌絲。我們深入研究了SDH2基因影響菌絲形成的機制。由于sdh2Δ/Δ的生長在很大程度上依賴可發(fā)酵碳源,我們首先考察了SDH2基因缺失菌的固體菌絲形成缺陷是否與糖酵解的代謝產(chǎn)物乙醇有關。我們推測sdh2Δ/Δ中乙醇可能發(fā)生了累積,依據(jù)是敲除SDH2基因后TCA循環(huán)中SDH的功能受到影響,可能導致TCA循環(huán)受阻,從而影響白念珠菌有氧呼吸過程,其代謝方式可能由有氧呼吸轉變?yōu)樘墙徒?在固體培養(yǎng)基上,糖酵解產(chǎn)生的乙醇副產(chǎn)物很可能積累在細胞內不能及時排出。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn),SDH2基因缺失菌的確存在胞內乙醇累積的現(xiàn)象,接下來我們通過3部分實驗對乙醇與白念珠菌菌絲形成的關系進行探究:(1)外加乙醇考察固體菌絲形成;(2)利用工具藥丙二酸(琥珀酸類似物,競爭性抑制琥珀酸脫氫酶活性從而阻斷TCA循環(huán)過程)阻斷有氧呼吸過程考察胞內乙醇含量和固體菌絲形成;(3)考察ADH1基因(編碼乙醇脫氫酶,催化乙醛還原到乙醇及其逆反應)敲除菌adh1Δ/Δ胞內乙醇含量和固體菌絲形成,但得到的結果不能支持這個結論。首先,我們發(fā)現(xiàn)在不同固體培養(yǎng)基中,乙醇對菌絲的影響并不一致,2~4%的乙醇在YPD+胎牛血清培養(yǎng)基中反而刺激了菌絲的形成。其次,丙二酸確實能夠抑制有氧呼吸過程,并令胞內乙醇累積,但相應的固體菌絲形成并沒有產(chǎn)生缺陷。此外,adh1Δ/Δ胞內乙醇含量明顯低于野生型白念珠菌,但固體菌絲形成能力并沒有更強,且對外加乙醇的敏感性也并沒有低于野生型�？偟膩碚f,白念珠菌胞內乙醇含量與菌絲形成能力沒有明確的正相關關系。由于SDH2基因同時在TCA循環(huán)和ETC發(fā)揮作用,我們進一步探究了是TCA循環(huán)還是ETC功能受損影響了菌絲形成。本部分實驗選取丙二酸(Malonate)和萎銹靈(Carboxin)兩種SDH不同功能位點的特異性抑制劑,和白念珠菌TCA循環(huán)特異性基因FUM12敲除菌fum12Δ/Δ作為考察工具。丙二酸特異性抑制SDH在TCA循環(huán)中催化琥珀酸脫氫為延胡索酸的功能,萎銹靈特異性抑制SDH在ETC中傳遞電子到泛醌的功能,FUM12基因編碼TCA循環(huán)中延胡索酸脫氫酶,基因敲除后TCA循環(huán)受阻。我們發(fā)現(xiàn)野生型白念珠菌施加1.5 mM的萎銹靈后,菌絲形成能力顯著下降并導致致病力降低,能夠重現(xiàn)出SDH2基因敲除后致病力和菌絲形成能力缺陷的現(xiàn)象,而相同濃度下丙二酸和敲除FUM12基因不能夠影響白念珠菌致病力和菌絲形成能力。由此我們推斷,sdh2Δ/Δ中ETC的功能受損是導致菌絲缺陷的主要原因,而菌絲形成主要與ETC相關,而非TCA循環(huán)過程。我們進一步研究了ETC功能影響菌絲形成機制。我們首先考察了sdh2Δ/Δ一系列線粒體功能指標和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生,發(fā)現(xiàn)sdh2Δ/Δ的ATP含量和線粒體膜電位與野生型沒有顯著差別,但ROS含量明顯高于野生型,排除了ATP不足以及線粒體膜電位異常導致基因缺失菌菌絲缺陷的可能,并推測ROS積累是可能原因。我們通過對sdh2Δ/Δ外加還原性物質(維生素E,原花青素)和對野生型外加ROS誘導物質改變胞內ROS水平,考察內源性ROS對固體菌絲形成能力的影響。發(fā)現(xiàn)外加還原性物質后sdh2Δ/Δ菌絲形成能力能夠恢復,且ROS誘導物質的確可以抑制白念珠菌菌絲形成。此外,我們通過降低環(huán)境中氧含量(缺氧條件,20%CO2)減少有氧呼吸進而減少胞內ROS產(chǎn)生,研究發(fā)現(xiàn)sdh2Δ/Δ在低氧條件下菌絲形成能力與野生型無異。綜合上述實驗結果,我們推測白念珠菌SDH2基因敲除后造成ROS積累是導致菌菌絲形成缺陷的主要原因。本課題揭示了SDH2基因敲除后通過影響ETC功能提高了細胞內ROS產(chǎn)生,從而導致白念珠菌菌絲形成能力以及致病力顯著下降。該研究提示白念珠菌線粒體電子傳遞鏈相關基因可能成為新型抗真菌藥物作用的靶點。
【關鍵詞】：白念珠菌 SDH2基因 菌絲 活性氧
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R379.4
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-15
• 一、實驗材料和方法15-32
• （一）菌株培養(yǎng)15
• （二）SDH2基因敲除菌的構建與鑒定15-17
• （三）倍增時間實驗17-18
• （四）利用線蟲模型考察致病力18-20
• （五）利用小鼠模型考察致病力20-22
• （六）固體菌絲實驗22-23
• （七）碳源利用實驗23-24
• （八）胞內乙醇含量檢測及外加乙醇后固體菌絲實驗24-26
• （九） 外加ETC和TCA循環(huán)抑制劑后線蟲感染實驗及固體菌絲實驗26-27
• （十）線粒體功能檢測27-29
• （十一）外加氧化性物質或還原性物質，或低氧條件下固體菌絲形成實驗29-32
• 二、實驗結果32-55
• （一）SDH2基因敲除構建及鑒定32
• （二）SDH2基因敲除后不影響白念珠菌生長32-33
• （三）SDH2基因敲除菌在線蟲模型上致病力下降33-34
• （四）SDH2基因敲除菌在小鼠系統(tǒng)感染模型上致病力下降34-36
• （五）SDH2基因敲除菌固體菌絲形成能力缺陷36-38
• （六）SDH2基因敲除菌利用非發(fā)酵碳源障礙38-39
• （七） SDH2敲除菌胞內乙醇累積但乙醇含量與菌絲形成無明確相關性39-43
• （八） ETC功能受損導致白念珠菌致病力和菌絲形成能力降低，而TCA循環(huán)受損則無此現(xiàn)象43-48
• （九） SDH2敲除菌胞內ROS產(chǎn)生增多，ATP和線粒體膜電位水平未見明顯異常48-50
• （十） 外加氧化劑能夠抑制白念珠菌菌絲，外加還原劑使SDH2基因敲除菌菌絲形成恢復正常50-55
• 三、討論55-61
• 參考文獻61-64
• 綜述 白色念珠菌的高適應性與代謝64-72
• 參考文獻70-72
• 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明72-73
• 致謝73

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