乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染是嚴(yán)重的全球性公共衛(wèi)生問題之一。干擾素和核苷類似物為目前臨床常用的抗乙肝藥物,在一定程度上能有效降低患者血清中的病毒數(shù)量,但易引起病毒耐藥性突變,且難以徹底清除宿主細(xì)胞內(nèi)HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（covalently closed circular DNA,cccDNA）。而新興的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)可以對(duì)許多物種基因組進(jìn)行DNA的精確編輯,這一高效、快捷的技術(shù)使得從根本上清除cccDNA成為了可能。本研究針對(duì)HBV基因組設(shè)計(jì)并構(gòu)建特異性CRISPR/Cas9系統(tǒng),在體外乙肝細(xì)胞模型HepG2.2.15中研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)對(duì)HBV DNA復(fù)制和抗原表達(dá)影響。同時(shí)應(yīng)用全基因組測(cè)序技術(shù)分析CRISPR/Cas9系統(tǒng)剪切cccDNA后對(duì)誘導(dǎo)病毒DNA整合的風(fēng)險(xiǎn)。研究首先針對(duì)HBV基因組設(shè)計(jì)并篩選靶序列,分別構(gòu)建HBV特異性sgNRA重組表達(dá)載體U6-X3sgRNA和U6-17sgRNA。載體經(jīng)測(cè)序鑒定后,與hCas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后分別應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光免疫分析法和熒光定量PC... 

【文章來源】：華南理工大學(xué)廣東省 211工程院校 985工程院校 教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：74 頁

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

HBV基因組結(jié)構(gòu)

圖 1-2 HBV 生活史[8]Fig. 1-2 The lifecycle of HBV的治療現(xiàn)狀染患者可導(dǎo)致慢性乙型肝炎，如果預(yù)后不良，可進(jìn)一步發(fā)展為等。因此，醫(yī)學(xué)界積極開展針對(duì) HBV 致病機(jī)理及抗病毒治療提高臨床治療效果，從而徹底治愈乙型肝炎。上世紀(jì)九十年代N）被批準(zhǔn)作為治療慢性乙型肝炎藥物開啟了治愈乙型肝炎的年代末期拉米夫定（lamivudine，LAM）為代表的核苷類似物型肝炎的的治療進(jìn)程，隨后多種治療藥物和多種治療方法相繼肝炎病毒藥物主要包括干擾素和核苷類似物等[9]。

圖 1-3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)Fig. 1-3 The structure of CRISPR/Cas system CRISPR/Cas 系統(tǒng)中 Cas 基因核心元件序列的不同，可將 CRISPR/CⅡ型和Ⅲ型三種不同類型。其中Ⅰ型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)分最為復(fù)雜，包含多個(gè)功能各不相同的 Cas 蛋白。該系統(tǒng)在防御外源 Cas 蛋白和成熟的 crRNA 形成 CRISPR 相關(guān)的病毒防御復(fù)合體（d complex for antivirus defense，CASCAD），CASCAD 在 crRNA 的介特異性結(jié)合，隨后指導(dǎo)具有核酸酶和解旋酶功能的 Cas3 蛋白將靶 D。Ⅲ型 CRISPR/Cas 系統(tǒng)常見于古細(xì)菌，在細(xì)菌中比較少見，其作用R/Cas 系統(tǒng)相類似，需要多個(gè) Cas 蛋白形成復(fù)合體參與外源核酸的降元件為 Cas10 蛋白。與上述兩種系統(tǒng)有所不同，Ⅱ型 CRISPR/Cas 系在發(fā)揮作用時(shí)僅需要一個(gè) Cas9 蛋白核酸酶來切割外源 DNA。目前使

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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碩士論文
[1]PiggyBac介導(dǎo)多藥物代謝酶穩(wěn)定表達(dá)肝細(xì)胞系的建立[D]. 賈英.華南理工大學(xué) 2015



本文編號(hào)：3095078