本文關(guān)鍵詞：傷寒多糖結(jié)合疫苗的生物合成研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：傷寒沙門氏菌(Salmonella enterica subspecies enterica serotype Typhi)是引發(fā)人類急性腸道傳染病傷寒的病原菌,具有強的侵襲性,產(chǎn)生內(nèi)毒素,由糞-口途徑傳播。傷寒是一種以發(fā)熱為主要表現(xiàn)的全身性疾病,曾在世界各地流行。隨著生活衛(wèi)生條件的改善和抗生素(特別是氯霉素)的使用,傷寒的發(fā)病率與其導(dǎo)致的死亡率在發(fā)達(dá)國家有大幅度的下降,而在亞非拉的一些發(fā)展中國家依舊是一個重要的公共衛(wèi)生問題。傷寒的常規(guī)治療方式是抗生素療法,但抗生素的長期使用造成了傷寒菌多重耐藥株的產(chǎn)生。而接種疫苗,是除了改善衛(wèi)生條件之外最有效的預(yù)防和控制手段,目前在全球范圍內(nèi)廣泛使用的是注射用Vi多糖疫苗和口服的Ty21a活疫苗。由于多糖疫苗屬于非T細(xì)胞依賴性抗原,免疫后不形成免疫記憶,產(chǎn)生的抗體主要是親和力較低的Ig M和Ig G2,且不能在嬰幼兒體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫力,而將細(xì)菌的聚糖與適當(dāng)?shù)牡鞍纵d體結(jié)合形成糖蛋白疫苗,屬于T細(xì)胞依賴性抗原,能夠產(chǎn)生更好、更長久的免疫保護(hù)效果。細(xì)菌中存在糖基化修飾、細(xì)菌蛋白糖基化過程與脂多糖的合成的相似性以及pgl基因簇具有糖基化底物蛋白功能的發(fā)現(xiàn),使得O抗原與免疫蛋白載體在細(xì)菌體內(nèi)結(jié)合成為了可能。本文采用改進(jìn)的λ-Red重組系統(tǒng),成功構(gòu)建了傷寒菌50096 waa L基因缺失株,同時利用低拷貝質(zhì)粒成功構(gòu)建了waa L回復(fù)株。對這野生株和新構(gòu)建的缺失株、回復(fù)株進(jìn)行脂多糖(LPS)銀染實驗,鑒定3株菌LPS表型,實驗結(jié)果表明缺失waa L基因?qū)е翷PS無法正常合成,在檢測凝膠中未形成長串的梯狀條帶。接著,對所構(gòu)建的菌株進(jìn)行生理生化特征研究,結(jié)果表明waa L的缺失對菌的生長幾乎沒有影響。隨后,向缺失株中導(dǎo)入含腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)蛋白糖基化途徑中糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)載體,以及改構(gòu)的重組銅綠假單胞菌(Pseudomonas Aeruginosa)外毒素A(r EPAN29)的表達(dá)載體,使重組菌細(xì)胞內(nèi)能夠誘導(dǎo)合成以傷寒OPS為目標(biāo)抗原、以r EPAN29為載體蛋白的傷寒OPS-r EPAN29糖蛋白復(fù)合物。隨后對其進(jìn)行了IPTG誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE電泳以及雙向電泳檢驗。檢測結(jié)果顯示,重組菌能表達(dá)傷寒OPS-r EPAN29糖蛋白復(fù)合物,且其蛋白表達(dá)譜僅存在較小差異。最后對糖蛋白復(fù)合物進(jìn)行了分離純化與免疫原性評價,ELISA測定血清抗體滴度表明,r EPAN29做為載體蛋白能有效增加糖鏈的免疫原性,糖蛋白比單獨的多糖能誘導(dǎo)產(chǎn)生更好的免疫應(yīng)答。該方法成功制備了傷寒O多糖結(jié)合疫苗,為糖蛋白疫苗的生產(chǎn)提供了新思路,理論上也適用于其他革蘭氏陰性菌的疫苗研發(fā)。
【關(guān)鍵詞】：結(jié)合疫苗 傷寒沙門氏菌 合成生物學(xué) 重組EPA O-多糖抗原
【學(xué)位授予單位】：吉首大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R392
【目錄】：

• 摘要9-10
• ABSTRACT10-12
• 第1章 前言12-16
• 1.1 傷寒沙門氏菌的致病與傳播12-13
• 1.2 傷寒的防治策略13-14
• 1.3 多糖疫苗14
• 1.4 糖蛋白疫苗14-15
• 1.5 選題目的與意義15-16
• 第2章 傷寒O-連接糖基化修飾途徑的構(gòu)建與IPTG誘導(dǎo)表達(dá)及檢測16-28
• 2.1 研究背景16
• 2.2 材料與方法16-23
• 2.2.1 菌株與質(zhì)粒16-17
• 2.2.2 主要試劑和耗材17
• 2.2.3 主要儀器與分析軟件17-18
• 2.2.4 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制18
• 2.2.5 waaL基因缺失突變株的構(gòu)建18-21
• 2.2.6 waaL回復(fù)突變株的構(gòu)建21
• 2.2.7 缺失突變株和回復(fù)突變株在分子水平上的驗證21
• 2.2.8 缺失突變株和回復(fù)突變株在表型上的驗證21-22
• 2.2.9 野生株、缺失株和回復(fù)株在生長狀態(tài)上的測定22
• 2.2.10 野生株、缺失株和回復(fù)株在生化試驗上的比較22
• 2.2.11 重組菌株的構(gòu)建與檢驗22
• 2.2.12 PglL與rEPAN29的誘導(dǎo)表達(dá)與檢測22-23
• 2.2.13 蛋白免疫印跡（Western Blot）23
• 2.3 結(jié)果23-27
• 2.3.1 缺失株和回復(fù)株在分子水平上的驗證23-24
• 2.3.2 缺失株和回復(fù)株在表型上的驗證24
• 2.3.3 野生株、缺失株和回復(fù)株在生長狀態(tài)上的測定24
• 2.3.4 野生株、缺失株和回復(fù)株在生化試驗上的比較24-26
• 2.3.5 PCR驗證重組菌26
• 2.3.6 PglL與rEPAN29在 50096△waaL中的誘導(dǎo)表達(dá)26-27
• 2.4 討論27-28
• 第3章 重組菌的雙向電泳檢測28-35
• 3.1 研究背景28
• 3.2 材料與方法28-31
• 3.2.1 菌株與質(zhì)粒28-29
• 3.2.2 主要試劑和耗材29
• 3.2.3 主要儀器與分析軟件29
• 3.2.4 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制29-30
• 3.2.5 全菌蛋白樣品的制備30
• 3.2.6 雙向電泳樣品的純化與上樣前處理30
• 3.2.7 雙向電泳：等電聚焦30-31
• 3.2.8 雙向電泳：SDS-PAGE31
• 3.2.9 蛋白點分析、膠內(nèi)酶切與質(zhì)譜分析31
• 3.3 結(jié)果31-33
• 3.3.1 重組菌的雙向電泳的圖譜比較31-32
• 3.3.2 差異蛋白質(zhì)譜結(jié)果鑒定32-33
• 3.4 討論33-35
• 第4章 傷寒O-多糖蛋白復(fù)合物的分離與純化35-39
• 4.1 研究背景35
• 4.2 材料與方法35-37
• 4.2.1 菌株35
• 4.2.2 主要試劑與耗材35-36
• 4.2.3 主要儀器與分析軟件36
• 4.2.4 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制36
• 4.2.5 IPTG誘導(dǎo)與菌液的預(yù)處理36
• 4.2.6 Chelating親和層析柱的初步純化36-37
• 4.2.7 初步純化樣品的除鹽37
• 4.2.8 SDS-PAGE檢測初步純化后的糖蛋白樣品37
• 4.2.9 ProteinPak DEAE8HR陰離子交換層析柱進(jìn)一步純化37
• 4.2.10 Superdex 75層析柱的凝膠過濾精細(xì)純化37
• 4.2.11 SDS-PAGE檢測精細(xì)純化后糖蛋白樣品37
• 4.3 結(jié)果37-38
• 4.3.1 初步純化后糖蛋白樣品的檢測37-38
• 4.3.2 精細(xì)純化后糖蛋白樣品的檢測38
• 4.4 討論38-39
• 第5章 糖蛋白純化產(chǎn)物的免疫原性評價39-45
• 5.1 研究背景39
• 5.2 材料與方法39-43
• 5.2.1 菌株與試驗動物39
• 5.2.2 主要試劑與耗材39-40
• 5.2.3 主要儀器與分析軟件40
• 5.2.4 培養(yǎng)基及相關(guān)溶液的配制40
• 5.2.5 傷寒菌脂多糖（LPS）的提取與檢測40-41
• 5.2.6 傷寒菌O-多糖（OPS）的制備與檢測41
• 5.2.7 LPS、OPS以及純化后糖蛋白的糖定量41
• 5.2.8 免疫樣品的制備41
• 5.2.9 小鼠的免疫試驗41-42
• 5.2.10 小鼠血清的采集42
• 5.2.11 間接ELISA法檢測血清中抗體滴度42-43
• 5.3 結(jié)果43-44
• 5.3.1 傷寒菌LPS、OPS的銀染檢測43
• 5.3.2 LPS、OPS以及純化后糖蛋白的糖定量43
• 5.3.3 ELISA檢測血清中抗體滴度43-44
• 5.4 討論44-45
• 第6章 結(jié)論與展望45-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-51
• 作者在學(xué)期間取得的學(xué)術(shù)成果51-52
• 附錄A 核酸試劑盒操作步驟52-56
• 附錄B 蛋白試劑盒操作步驟56

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本文編號：294477