目的： 本研究改進(jìn)了諾卡菌的抗酸染色方法，并以rpoB作為靶基因，用諾卡菌標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行PCR-RFLP分型鑒定研究，旨在建立諾卡菌快速鑒定PCR-RFLP操作方案和RFLP標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，為臨床快速、準(zhǔn)確鑒別診斷提供可靠的參考標(biāo)準(zhǔn)。 材料和方法： 1.采用革蘭染色方法和抗酸染色方法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌進(jìn)行染色，同時(shí)設(shè)計(jì)7個(gè)濃度梯度的脫色液，進(jìn)行改良抗酸染色，綜合比較三種染色方法的結(jié)果。 2.分別對(duì)7種23株諾卡菌國(guó)際參考株的rpoB基因的360bp特異片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）分析。 結(jié)果： 1.在顯微鏡下觀察諾卡菌有三種形態(tài)，分別為桿狀、絲狀和球狀。用0.125%的硫酸和0.063%的硫酸作為脫色液的改良抗酸染色方法染色陽(yáng)性率最高，為100%；用4%硫酸脫色的改良抗酸染色方法染色陽(yáng)性率最低，為30.43%。所用硫酸脫色液濃度為4%、2%、1%、0.5%的改良抗酸染色法進(jìn)行染色時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果始終為陽(yáng)性，陰性對(duì)照結(jié)果均為陰性；使用硫酸脫色液濃度為0.25%、0.125%、0.063%的改良抗酸染色時(shí)，陰性對(duì)照染色結(jié)果為假陽(yáng)性。2.應(yīng)用單一限制性內(nèi)切酶HaeIII對(duì)rpoB基因360bp的純化PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得到7種圖譜，將7種諾卡菌分成7類，應(yīng)用單一限制性內(nèi)切酶MspI對(duì)rpoB基因360bp的純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切得到16種圖譜，將7種諾卡菌分成16類。HaeIII和MspI兩種限制性內(nèi)切酶聯(lián)合應(yīng)用共得到16種圖譜，其中新星諾卡菌和豚鼠諾卡菌具有種特異性圖譜，，星形諾卡菌有3種圖譜，巴西諾卡菌有4種圖譜，鼻疽諾卡菌有3種圖譜，肉色諾卡菌有2種圖譜，南非諾卡菌有2種圖譜。 結(jié)論： 1.在陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照都獲得準(zhǔn)確結(jié)果的基礎(chǔ)上，0.5%硫酸脫色液改良抗酸染色方法為最佳染色方法，對(duì)諾卡菌的檢出率最高，為91.3%。 2.本研究建立的PCR-RFLP方法共得到16種圖譜，能明確鑒定7種23株諾卡菌，為臨床諾卡菌的鑒定和防治研究提供了良好的基礎(chǔ)。 3．對(duì)中國(guó)四省臨床分離37株諾卡菌的鑒定，36株屬于鼻疽諾卡菌，1株屬于小球諾卡菌。



本文編號(hào)：1448118