本文關(guān)鍵詞：過量表達(dá)擬南芥CAT影響煙草對氣體甲醛吸收的機(jī)理研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：現(xiàn)代工業(yè)將大量甲醛使用在裝修材料中,使甲醛成為我國室內(nèi)空氣污染的首要污染物。在眾多的甲醛治理方法中,植物凈化法以其環(huán)保、經(jīng)濟(jì)、便捷等優(yōu)點(diǎn)受到人們的關(guān)注和青睞。普通的觀賞植物由于它們的氣體甲醛吸收能力普遍較低,所以清除甲醛的效果都不太理想。有研究表明植物受氣體甲醛脅迫時(shí)體內(nèi)會(huì)積累大量的H202,而H202誘發(fā)一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來促進(jìn)氣孔的關(guān)閉,從而降低植物對氣體甲醛的吸收效率。本研究試圖在野生型煙草葉綠體中過量表達(dá)擬南芥CAT(過氧化氫酶),提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗氧化酶活性,使其受氣體甲醛脅迫時(shí)能及時(shí)有效的清除體內(nèi)積累的H202,從而使氣孔保持較大的開度和導(dǎo)度,提高甲醛吸收效率,為利用基因工程手段提高植物甲醛修復(fù)污染能力提供新的操作策略和理論依據(jù),取得的主要研究結(jié)果如下：1.為使CAT表達(dá)后能定位到葉綠體中,利用Gateway技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)由光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Prbcs)驅(qū)動(dòng)CAT表達(dá)的植物表達(dá)載體pK2-PrbcS-*T-CAT,通過該載體表達(dá)的CAT蛋白可通過Prbcs下游葉綠體基質(zhì)定位信號肽(*T)引導(dǎo)到植物葉綠體中。利用pK2-PrbcS-*T-CAT轉(zhuǎn)化野生型煙草(WT)獲得卡那霉素(Km)抗性的轉(zhuǎn)基因株系5個(gè),基因組PCR分析確認(rèn)5個(gè)Km抗性株系中均有CAT基因插入,RT-PCR分析證實(shí)5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均有CAT基因的表達(dá),測定CAT活性選出CAT活性較高的轉(zhuǎn)基因煙草株系C1和C3。2.分析高濃度氣體甲醛脅迫對WT和C1、C3轉(zhuǎn)基因煙草生理特性的影響,結(jié)果說明10-20ppm氣體甲醛脅迫短時(shí)間后,C1、C3轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度和開度高于WT,而氧化脅迫相關(guān)指標(biāo)H202、丙二醛(MDA)、羰基化蛋白(PC)含量低于WT。H202熒光探針分析證實(shí)在10 ppm氣體甲醛下C1、C3葉片下表皮中積累H202的保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)顯著少于WT。C1、C3轉(zhuǎn)基因煙草對10-20ppm氣體甲醛吸收效率也高于WT。保衛(wèi)細(xì)胞中含有葉綠體,葉綠體是保衛(wèi)細(xì)胞中H2O2的最大來源,過量表達(dá)CAT可能通過降低氣體甲醛脅迫下Cl、C3保衛(wèi)細(xì)胞中H202的積累而增加葉片的氣孔導(dǎo)度和開度,從而增加它們的氣體甲醛吸收效率。免疫共沉淀分析表明,在10-20ppm氣體甲醛脅迫下,C1、C3轉(zhuǎn)基因煙草葉片中14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATPase的互作水平高于WT；它們的質(zhì)膜H+-ATPase活性和氫泵活性也高于WT。說明過量表達(dá)CAT的C1、C3煙草葉片能及時(shí)清除氣體甲醛脅迫積累的H202,從而能降低H202引起的氣孔關(guān)閉的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,使促進(jìn)14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATPase的結(jié)合,進(jìn)而增強(qiáng)質(zhì)膜H+-ATPase活性和氫泵活性,使氣孔開度和導(dǎo)度增加。3.利用家具中的污染的低濃度氣體甲醛處理WT和C1、C3轉(zhuǎn)基因煙草,考轉(zhuǎn)基因和WT煙草甲醛污染環(huán)境中長時(shí)間(72 h)放置后對甲醛脅迫的應(yīng)答效果,結(jié)果和高濃度處理的相似,轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度和開度高于WT; H2O2、 MDA、PC氧化損傷指標(biāo)較低,C1、C3葉片中積累H2O2的保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)少于WT煙草。免疫共沉淀和Western分析表明,氣體甲醛脅迫72 h后轉(zhuǎn)基因煙草14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATPase的互作水平高于WT；質(zhì)膜H+-ATPase活性和氫泵活性也高于WT。這些結(jié)果說明減少氣體甲醛脅迫下葉片中H202的積累,增加14-3-3蛋白和質(zhì)膜H+-ATPase的互作使質(zhì)膜H+-ATPase活性和氫泵活性提高是過量表達(dá)的CAT增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草在氣體甲醛脅迫的氣孔運(yùn)動(dòng)和甲醛吸收的重要機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：過氧化氫酶 氣體甲醛脅迫 氣孔運(yùn)動(dòng) 質(zhì)膜H~+-ATPase 甲醛吸收
【學(xué)位授予單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：X51;Q945
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-18
• 縮略詞18-19
• 第一章 緒論19-42
• 1.1 甲醛污染現(xiàn)狀及其危害19-20
• 1.1.1 甲醛的性質(zhì)19
• 1.1.2 甲醛的污染來源及現(xiàn)狀19-20
• 1.1.3 甲醛對人體的危害20
• 1.2 甲醛污染的治理方法20-22
• 1.2.1 物理方法和化學(xué)方法20-21
• 1.2.2 生物清除法21-22
• 1.3 植物HCHO吸收能力和吸收機(jī)理的研究進(jìn)展22-29
• 1.3.1 植物HCHO吸收能力的研究進(jìn)展22-23
• 1.3.2 植物吸收氣體HCHO機(jī)理的研究進(jìn)展23-29
• 1.3.2.1 調(diào)控植物氣孔開放的相關(guān)因素23-28
• 1.3.2.2 植物HCHO吸收的代謝途徑的研究28-29
• 1.4 提高植物HCHO代謝能力和抗性的遺傳工程研究進(jìn)展29-32
• 1.4.1 過量表達(dá)FDH/SHMT提高轉(zhuǎn)基因煙草吸收HCHO能力的遺傳操作29-30
• 1.4.2 轉(zhuǎn)入甲醛光合同化途徑提高轉(zhuǎn)基因植物吸收HCHO能力的遺傳工程30-32
• 1.4.3 甲醛脫氫酶(FALDH)和其他基因的轉(zhuǎn)入提高植物甲醛修復(fù)能力的遺傳工程32
• 1.5 植物響應(yīng)HCHO脅迫生理機(jī)理和分子機(jī)理的研究進(jìn)展32-36
• 1.5.1 HCHO脅迫對植物生理生化特性的影響32-33
• 1.5.2 植物響應(yīng)HCHO脅迫應(yīng)答基因的研究進(jìn)展33-36
• 1.5.2.1 代謝和能量相關(guān)基因33-34
• 1.5.2.2 光合相關(guān)基因34-35
• 1.5.2.3 防御相關(guān)基因35-36
• 1.6 過氧化氫和過氧化氫酶概述36-40
• 1.6.1 過氧化氫簡介36-37
• 1.6.2 過氧化氫酶的結(jié)構(gòu)特征37
• 1.6.3 過氧化氫酶的生理功能37-39
• 1.6.3.1 植物的抗逆信號分子37-38
• 1.6.3.2 增強(qiáng)植物的光合能力及延緩衰老38
• 1.6.3.3 維持植物細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡38-39
• 1.6.4 過氧化氫酶基因的克隆和轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性39-40
• 1.7 本研究的目的和意義40-42
• 第二章 過量表達(dá)擬南芥CAT植物表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)基因植物的鑒定42-53
• 2.1 材料與方法42-49
• 2.1.1 植物材料培養(yǎng)43
• 2.1.2 菌株及相關(guān)載體與材料43
• 2.1.3 CAT入門克隆載體pENTR~*-PrbcS-~*T-CAT和植物過表達(dá)載體pK_2-PrbcS-~*T-CAT的構(gòu)建43-46
• 2.1.4 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因煙草的培養(yǎng)與篩選46-47
• 2.1.5 過表達(dá)CAT轉(zhuǎn)基因煙草基因組插入和轉(zhuǎn)錄水平的檢測47-48
• 2.1.6 過表達(dá)CAT轉(zhuǎn)基因煙草CAT活性的檢測48
• 2.1.7 大量培養(yǎng)無菌轉(zhuǎn)基因煙草幼苗48-49
• 2.1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析49
• 2.2 結(jié)果與分析49-51
• 2.2.1 植物過表達(dá)載體pK_2-PrbcS-~*T-CAT的構(gòu)建49-50
• 2.2.2 過表達(dá)CAT轉(zhuǎn)基因煙草的鑒定50-51
• 2.3 討論51-53
• 第三章 過量表達(dá)擬南芥CAT增強(qiáng)煙草對氣體甲醛吸收和生理抗性53-69
• 3.1 材料與方法54-58
• 3.1.1 植物材料培養(yǎng)54
• 3.1.2 轉(zhuǎn)基因煙草對氣體甲醛吸收能力的測定54-55
• 3.1.3 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率的測定55
• 3.1.4 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草氣孔開度的觀察55
• 3.1.5 葉綠素含量的測定55
• 3.1.6 可溶性糖和總蛋白含量的測定55-56
• 3.1.7 H_2O_2熒光標(biāo)記染色56-57
• 3.1.8 H_2O_2、MDA和PC含量的測定57-58
• 3.1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析58
• 3.2 結(jié)果與分析58-66
• 3.2.1 過量表達(dá)擬南芥CAT的轉(zhuǎn)基因煙草植株吸收氣體甲醛能力58-60
• 3.2.2 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度、開度及蒸騰速率的比較60-62
• 3.2.4 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的變化62-63
• 3.2.5 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草可溶性總糖和總蛋白含量的變化63-64
• 3.2.6 H_2O_2探針檢測氣體HCHO脅迫處理煙草葉片中的H_2O_264-65
• 3.2.7 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片H_2O_2、MDA和PC含量的變化65-66
• 3.3 討論66-69
• 第四章 過量表達(dá)擬南芥CAT增強(qiáng)煙草對氣體甲醛吸收的分子機(jī)理研究69-76
• 4.1 材料與方法69-71
• 4.1.1 脅迫處理的煙草葉片質(zhì)膜提取和PM H~+-ATP酶活性測定69-70
• 4.1.2 脅迫處理的煙草葉片氫泵活性測定70
• 4.1.3 14-3-3蛋白抗體、向光素抗體及質(zhì)膜H~+-ATPase抗體的制備70
• 4.1.4 免疫共沉淀檢測14-3-3蛋白與質(zhì)膜H~+-ATP酶和向光素的互作70-71
• 4.1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析71
• 4.2 結(jié)果與分析71-74
• 4.2.1 氣體甲醛脅迫對煙草葉片14-3-3蛋白與向光素、質(zhì)膜H~+-ATPase互作的影響71-72
• 4.2.2 氣體甲醛脅迫對煙草葉片質(zhì)膜H~+-ATPase活性的影響72-73
• 4.2.3 氣體甲醛脅迫對煙草葉片氫泵活性的影響73-74
• 4.3 討論74-76
• 第五章 過量表達(dá)擬南芥CAT增強(qiáng)煙草對環(huán)境污染氣體甲醛吸收的機(jī)理研究76-88
• 5.1 材料與方法76-78
• 5.1.1 植物材料培養(yǎng)76-77
• 5.1.2 氣體甲醛脅迫處理的方法77
• 5.1.3 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度、開度及蒸騰速率的測定77
• 5.1.4 葉綠素含量的測定77
• 51.5 可溶性糖和總蛋白含量的測定77
• 5.1.6 H_2O_2探針檢測脅迫處理煙草葉片中的H_2O_277
• 5.1.7 H_2O_2、MDA和PC含量的測定77
• 5.1.8 脅迫處理的煙草葉片質(zhì)膜提取和PM H~+-ATP酶活性測定77
• 5.1.9 脅迫處理的煙草葉片氫泵活性的測定77-78
• 5.1.10 14-3-3 蛋白抗體、向光素抗體及質(zhì)膜H~+-ATPase抗體的制備78
• 5.1.11 免疫共沉淀檢測14-3-3蛋白與向光素、質(zhì)膜H~+-ATPase的互作78
• 5.1.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析78
• 5.2 結(jié)果與分析78-86
• 5.2.1 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草氣孔導(dǎo)度、開度及蒸騰速率的比較78-81
• 5.2.2 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉綠素含量的變化81-82
• 5.2.3 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草可溶性總糖和總蛋白含量的變化82-83
• 5.2.4 H_2O_2探針檢測脅迫處理煙草葉片中的H_2O_283-84
• 5.2.5 氣體甲醛脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片MDA、H_2O_2和PC含量的變化84-85
• 5.2.6 氣體甲醛脅迫對煙草葉片14-3-3蛋白與向光素、PMH~+-ATPase的互作水平,以及對PM H~+-ATPase活性、氫泵活性的影響85-86
• 5.3 討論86-88
• 第六章 總結(jié)與展望88-90
• 6.1 總結(jié)88-89
• 6.2 展望89-90
• 致謝90-91
• 參考文獻(xiàn)91-105
• 附件A105

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：過量表達(dá)擬南芥CAT影響煙草對氣體甲醛吸收的機(jī)理研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：442179