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UPR聯(lián)合SREBP
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本站編輯：admin 日期： 2010-08-17 21:26 點擊：次
【中文摘要】:
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【中文摘要】非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是近年來逐漸認識到的十分常見的慢性肝病,包括單純性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver,NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)和NASH相關性肝纖維化及肝硬化。NASH具有脂肪變性、肝細胞損傷及炎癥細胞浸潤等病理改變,可發(fā)展演化為肝硬化、肝癌,一般預后較差。NASH的發(fā)病機制至今尚未明確,目前普遍接受的是以胰島素抵抗(insulinresistance,IR)、氧化應激和脂質過氧化為中心的“二次打擊”學說。肝細胞內(nèi)有豐富的內(nèi)質網(wǎng),是蛋白質合成、折疊、運輸以及儲存鈣的主要場所。內(nèi)質網(wǎng)對各種刺激極為敏感,當機體功能紊亂時出現(xiàn)錯誤折疊與未折疊蛋白在腔內(nèi)聚集以及細胞內(nèi)鈣平衡紊亂的狀態(tài),稱為內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)。ERS主要激活三條信號通路:未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)、超負荷反應(endoplasmic reticulum overload response,EOR)和固醇調節(jié)級聯(lián)反應。近年來對于ERS信號通路及其效應在代謝綜合征(metabolic syndrome,MS)如肥胖、IR和2型糖尿病等中的研究十分廣泛。因此,我們認為作為與MS密切相關的NASH,其發(fā)病機制可能與ERS信號通路存在重要的聯(lián)系。既往研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸在內(nèi)質網(wǎng)代謝會產(chǎn)生一定量的活性氧(reactive oxygenspecies,ROS),而ROS又是ERS的重要誘發(fā)因素,因此我們推測當高脂飲食引起脂肪酸過載時,通過產(chǎn)生ROS和脂質過氧化物觸發(fā)肝絀胞發(fā)生ERS,啟動UPR和固醇調節(jié)級聯(lián)反應信號途徑,其中固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c(sterol regulatory element bindingprotein,SREBP-1c)表達上調,可增加脂肪合成酶等的表達,造成脂肪酸合成異常增多,肝臟脂質代謝障礙;當出現(xiàn)過強或者持久刺激時,內(nèi)質網(wǎng)功能紊亂得不到修正,造成UPR過載,激發(fā)氧化應激,引起脂肪變的肝細胞發(fā)生變性和壞死,從而導致NASH的發(fā)生。本研究旨在通過檢測ERS時UPR和固醇調節(jié)級聯(lián)反應中的標志性分子在高脂飲食誘導大鼠NASH形成中的表達變化,初步探討ERS在NASH形成中的作用及意義。主要研究內(nèi)容和結果如下:研究內(nèi)容和方法:Wistar成年雄性大鼠30只,隨機分為對照組(C組)與NASH組。其中NASH組分為4、8、12、16周4個時相點,各時相點隨機分配6只動物。C組給予基礎飼料,NASH組給予高脂飼料(基礎飼料82.5%,豬油10%,膽固醇2%,蔗糖5%,膽鹽0.5%)。動態(tài)觀察各組:①HE染色光鏡觀察肝臟組織病理改變;②血清FFA、TG、ALT、AST含量的測定;③肝組織MDA、FFA、ROS含量的測定;④半定量RT-PCR檢測ERS標志物GRP78、UPR標志物ATF6和固醇調節(jié)級聯(lián)反應標志物SREBP-1c mRNA的表達變化;⑤相對定量PCR檢測GRP78、ATF6 mRNA的表達變化;⑥Western blot法檢測GRP78、ATF6、Phospho-PERK、SREBP-1c的蛋白表達變化。研究結果:1、HE染色觀察肝組織病理學改變結果顯示C組大鼠肝臟大體形態(tài)和病理切片均正常。高脂喂養(yǎng)4、8、12、16周后,肉眼可見大鼠肝臟色澤變黃,包膜緊張,邊緣圓鈍,切面黃色、油膩,組織松脆;隨高脂喂養(yǎng)時間的延長,病理學可見肝細胞脂肪變及氣球樣變,小葉中央?yún)^(qū)炎癥,腺泡3帶出現(xiàn)點灶狀壞死,并逐漸發(fā)展至門管區(qū)輕～中度炎癥。按非酒精性脂肪性肝病診療指南劃分為:NASH-F1G0期、F2G1期、F3G2期、F4G3期。2、血清FFA、TG、ALT、AST的含量變化高脂喂養(yǎng)4周后,G0組血清FFA、TG、AST含量逐漸升高,隨著高脂喂養(yǎng)時間的延長,G1和G2組血清中FFA、TG、ALT、AST含量明顯增高,在16周G3組時達到高峰,與C組相比相差非常顯著(P＜0.01)。3、肝組織MDA、FFA、ROS的含量變化高脂喂養(yǎng)NASH各組大鼠肝組織MDA含量與C組相比顯著升高(P＜0.01)。肝組織FFA、ROS含量由高脂喂養(yǎng)4周時開始逐步升高,16周上升最為明顯(P＜0.01)。4、半定量RT-PCR檢測GRP78、ATF6和SREBP-1c mRNA表達變化高脂喂養(yǎng)4周后,GRP78和SREBP-1c mRNA水平隨肝細胞脂肪變和炎癥程度的加重而升高,在G3組中達到高峰(P＜0.01)。ATF6 mRNA水平在G0組與C組相比無明顯差異(P＞0.05),在G1、G2、G3組時與C組相比明顯升高(P＜0.01)。5、相對定量PCR檢測GRP78、ATF6 mRNA的表達變化將C組樣本設為對照,得出NASH各組樣本中目的基因GRP78和ATF6相對對照樣本的含量比值。結果顯示NASH各組GRP78和ATF6 mRNA的表達水平與C組相比升高(P＜0.05),與半定量RT-PCR結果趨勢一致。6、Western blot法檢測GRP78、ATF6、Phospho-PERK和SREBP-1c蛋白表達變化高脂喂養(yǎng)4周后,GRP78、ATF6和SREBP-1c蛋白表達開始增強,并隨高脂喂養(yǎng)時間延長逐漸增高,在G3組時達到高峰(P＜0.01)。Phospho-PERK蛋白水平在喂養(yǎng)4周時與C組相比無顯著差異(P＞0.05),在G3組時達高峰(P＜0.01)。結論:1、高脂飲食誘導FFA生成增加,在FFA氧化過程中產(chǎn)生大量ROS、MDA,導致脂質過氧化產(chǎn)物在肝臟內(nèi)過度累積,引發(fā)內(nèi)質網(wǎng)應激的因素增加;2、在大鼠NASH形成過程中,ERS標志物GRP78和UPR標志物ATF6、Phospho-PERK以及固醇調節(jié)級聯(lián)反應標志物SREBP-1c表達水平有隨著肝臟炎癥程度不斷加重而升高的趨勢;3、高脂飲食引起ROS等應激因素增加,通過啟動UPR聯(lián)合SREBP-1c造成ERS過度,表現(xiàn)為GRP78、ATF6、Phospho-PERK以及SREBP-1c表達水平升高,一方面增強脂肪酸相關酶基因轉錄導致肝細胞脂肪變,另一方面通過UPR作用最終導致NASH形成。
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