本文關(guān)鍵詞：實(shí)驗(yàn)室診斷，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

賀聯(lián)印　楊鐵生

寄生蟲病實(shí)驗(yàn)室診斷的進(jìn)展

賀聯(lián)印　楊鐵生

　　寄生蟲病目前仍是危害我國人民身體健康的重要疾病。根據(jù)1992～1994年全國調(diào)查報(bào)告，共發(fā)現(xiàn)我國有人體寄生蟲56種，主要為腸道寄生蟲。其中半數(shù)以上為不常見蟲種。尚不包括瘧疾、黑熱病、血吸蟲、絲蟲以及弓形蟲、卡氏肺孢子蟲、巴貝西蟲和錐蟲等重要寄生蟲。人均寄生蟲感染率高達(dá)62.6%。估計(jì)全國有7億多人感染寄生蟲，最多的1人同時(shí)感染9種寄生蟲，特別在農(nóng)村人口中。因此對(duì)寄生蟲的檢驗(yàn)工作仍是檢驗(yàn)人員應(yīng)該掌握的基本技術(shù)。但近年來，一些醫(yī)院的檢驗(yàn)人員逐漸忽略了對(duì)寄生蟲的檢驗(yàn)技術(shù)，常延誤了診斷，影響給予患者應(yīng)有的治療，甚至造成嚴(yán)重的后果。這就要求檢驗(yàn)人員能熟悉各種寄生蟲的生活史及它們各個(gè)時(shí)期的形態(tài)特征。要求掌握對(duì)各種標(biāo)本的處理技術(shù)(如取材、制片、染色、鏡檢)及必要的免疫學(xué)檢驗(yàn)方法。
　　以下僅就近年來有關(guān)臨床寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)的發(fā)展情況作一些簡單的介紹�！　�
寄生蟲病的寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)
　　寄生蟲病的寄生蟲學(xué)檢驗(yàn)仍以傳統(tǒng)的方法為主。可以查閱有關(guān)書籍或資料。這里只簡單介紹。
　　1.糞便檢查，常規(guī)鹽水涂片法常易漏診一些原蟲，特別是包囊。因此建議使用碘伊紅染液，可使原蟲易于檢出。如要清楚的辨明內(nèi)部結(jié)構(gòu)則應(yīng)做涂片，再以勞氏酸性紅、固綠染色法或改良果氏三色染色法制片，以油浸鏡鏡檢，才能準(zhǔn)確診斷。如疑有隱孢子蟲、微孢子蟲、圓孢子蟲則需做改良抗酸染色法確定診斷。為提高蟲卵檢出率，可選用加藤厚涂片法或醛醚沉淀法。涂片必須加蓋片，以高倍或油浸鏡頭觀察。
　　2.血液、體液或組織內(nèi)原蟲如瘧原蟲、利什曼原蟲、錐蟲、弓形蟲、巴比西蟲等，染色仍以瑞氏及姬氏染色法為主。以油浸鏡頭觀察。微絲蚴染色除姬氏法外，還可用品藍(lán)伊紅快速染色法。效果較好。
　　3.卡氏肺孢子蟲為一種機(jī)會(huì)性感染原蟲(或真菌)，可在痰內(nèi)或支氣管灌洗液內(nèi)查到。可用姬氏染色法或甲苯胺藍(lán)(TBO)染色法，或環(huán)已烷四胺硝酸銀(GMS)染色法檢出。用油浸鏡頭觀察。
寄生蟲病的免疫學(xué)診斷
　　寄生蟲病的診斷除了要掌握流行病學(xué)資料、詢問病史以及體格檢查以外，應(yīng)盡可能尋找病原體。但在有些時(shí)候，檢測病原體十分困難，需要采用免疫學(xué)診斷方法來檢測抗原和抗體，或進(jìn)行DNA檢測。
　　一、應(yīng)用于免疫學(xué)診斷的寄生蟲抗原與抗體
　　應(yīng)用于免疫學(xué)診斷的抗原有蟲體抗原、排泄分泌抗原和膜抗原等。目前抗原的提取、分離、純化越來越適合于免疫學(xué)診斷。蟲體抗原是最常用的抗原，大致可分為整體抗原和可溶性抗原。整體抗原包括蟲體、幼蟲和蟲卵。可溶性抗原包括粗抗原和部分純化抗原，可作為皮試、血凝、ELISA、乳凝等的抗原。目前多采用純化抗原，以提高試驗(yàn)的敏感性和特異性。
　　排泄分泌抗原又稱代謝抗原。多收集自蟲體的培養(yǎng)液，為功能性抗原，有較好的免疫原性，可以應(yīng)用于免疫診斷。膜抗原分為膜表面蛋白和膜組成蛋白。前者可用金屬螯合物或高離子強(qiáng)度的緩沖液溶解；后者可用清潔劑、有機(jī)溶劑和其它試劑如尿素、鹽酸胍而獲得。提取后可用于免疫診斷。此外，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組抗原越來越多的應(yīng)用于免疫學(xué)診斷中。
　　應(yīng)用于免疫學(xué)診斷的抗寄生蟲抗體一般采用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物抗血清。近年單克隆抗體應(yīng)用越來越廣泛。
　　二、寄生蟲病常用的免疫學(xué)診斷方法
　　目前，幾乎所有免疫學(xué)方法均可用于寄生蟲病的診斷，但并不是都很理想�，F(xiàn)介紹幾種常用的免疫學(xué)診斷方法。
　　1.環(huán)卵沉淀試驗(yàn)(COPT)：這是國內(nèi)外公認(rèn)的用以診斷血吸蟲病的有效血清學(xué)方法之一�，F(xiàn)在該法已趨向完善，不但提高了它的診斷效果，而且使該法更適合于現(xiàn)場推廣應(yīng)用。蟲卵的處理有甲醛處理冰凍干卵抗原；熱處理超聲干卵抗原等。方法有雙面膠紙條法、蠟封片法、塑料管、薄膜抗原片COPT，聚乙烯醇縮甲醛氯仿COPT(PVF-COPT)等，均有實(shí)用價(jià)值，已經(jīng)作為基本消滅和消滅血吸蟲病地區(qū)首先考慮應(yīng)用的血清免疫學(xué)診斷方法。
　　2.間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)：已用于多種寄生蟲病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查。可分為間接血凝(IHA)，反向間接血凝(RIHA)，間接血凝抑制試驗(yàn)(IHAI)，反向間接血凝抑制試驗(yàn)(RIHAI)，可以檢測抗原或抗體，有較高的敏感性和一定的特異性。單克隆抗體的應(yīng)用使敏感性和特異性有所提高。
　　3.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：目前國外已將ELISA廣泛應(yīng)用于寄生蟲病免疫學(xué)診斷中。許多商品試劑盒已被引入國內(nèi)，只是價(jià)錢較貴，限制了它的應(yīng)用。國內(nèi)也研制了多種試劑盒，推廣應(yīng)用于各種寄生蟲病診斷中。例如：血吸蟲病、肺吸蟲病、黑熱病、包蟲病、弓形蟲病、隱孢子蟲病、卡氏肺孢子蟲病、囊蟲病、阿米巴病等。除傳統(tǒng)的ELISA外，又發(fā)展了K-ELISA、ABC-ELISA、DOT-ELISA、薄膜ELISA等，應(yīng)用于血吸蟲病、肺吸蟲病、肝吸蟲病等�？蓽y抗體，也可測循環(huán)抗原及糞便樣品、膿液及其它體液中的抗原。目前存在的問題主要有抗原制備和試驗(yàn)方法尚需進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。
　　4.間接熒光抗體試驗(yàn)(IFAT)：在國外已廣泛應(yīng)用IFAT作為寄生蟲病的免疫學(xué)診斷方法。國內(nèi)主要應(yīng)用該法診斷瘧疾、絲蟲病、弓形蟲病。在血吸蟲病、肺吸蟲病、華支睪吸蟲病、包蟲病、阿米巴病等也有應(yīng)用。IFAT有較高的敏感性、特異性和重現(xiàn)性。但試驗(yàn)結(jié)果需用熒光顯微鏡觀察反應(yīng)，限制了該法的廣泛應(yīng)用。結(jié)果判定尚需有經(jīng)驗(yàn)的人員，有一定的主觀性。該法可檢測血清中的抗體，也可檢測組織內(nèi)的寄生蟲，如利什曼原蟲、阿米巴、瘧原蟲、弓性蟲等。
　　5.乳膠凝集試驗(yàn)(LAT)：LAT是以膠乳微粒作為載體的凝集反應(yīng)。主要應(yīng)用于弓形蟲病、囊蟲病、旋毛蟲病、血吸蟲病、棘球蚴病等診斷。該法有較好的敏感性和特異性，方法簡便，判斷結(jié)果快速，適于現(xiàn)場應(yīng)用。國內(nèi)外均有試劑盒供應(yīng)，但國內(nèi)應(yīng)用不是很廣泛。
　　6.免疫印跡技術(shù)(IBT)又稱Western印跡試驗(yàn)：是以聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)移電泳、固相酶免疫試驗(yàn)三種方法合一的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，是近年來發(fā)展迅速的一種新技術(shù)。已應(yīng)用于血吸蟲病、絳蟲病、包蟲病、肺吸蟲病、卡氏肺孢子蟲、阿米巴病、囊蟲病等。隨著技術(shù)的完善，IBT可望成為高度敏感和特異的診斷寄生蟲病和區(qū)別寄生蟲感染期的有效方法。
　　7.免疫層析技術(shù)(ICT)：ICT是近年來發(fā)展起來的快速診斷技術(shù)，可檢測抗體或抗原。應(yīng)用于寄生蟲病的有惡性瘧原蟲/間日瘧原蟲抗原檢測和班氏絲蟲抗原及利什曼原蟲抗原檢測。該法敏感、快速、特異性較好，，適于臨床快速診斷和現(xiàn)場調(diào)查。目前商品試劑盒已引進(jìn)國內(nèi)(澳卡)。
　　8.PCR和核酸分子雜交技術(shù)：隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR基因擴(kuò)增技術(shù)及核酸分子雜交技術(shù)已越來越多的應(yīng)用于寄生蟲病的診斷和研究之中。如錐蟲病、利什曼病、肺孢子蟲病、賈第蟲病、弓形蟲病、血吸蟲病、阿米巴病、包蟲病、瘧疾、絲蟲病和腸球蟲病等。這些技術(shù)雖具有高度的敏感性和特異性，但由于技術(shù)條件的要求很高，目前尚僅限于實(shí)驗(yàn)室試用階段，尚無合格的商品試劑供應(yīng)。
　　總之，由于免疫技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)、單克隆抗體的應(yīng)用，已使寄生蟲病免疫學(xué)診斷方法達(dá)到了簡易、微量、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的目的，顯著地提高了診斷效果。相信隨著高新技術(shù)的應(yīng)用，將使寄生蟲病免疫學(xué)診斷方法具有更為理想的診斷價(jià)值，以彌補(bǔ)病原學(xué)診斷的某些缺陷和不足。
　　三、常見寄生蟲病的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室
　　寄生蟲病有許多種，有些為地區(qū)性，有些發(fā)病率不高。因此，下面簡單介紹幾種常見寄生蟲病的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。
　　1.阿米巴�。喊⒚装筒》帜c道阿米巴病和腸外阿米巴病。腸道阿米巴病的診斷仍以糞便中發(fā)現(xiàn)阿米巴原蟲為可靠依據(jù)。血清中抗體的測定有一定的參考價(jià)值，方法有IHA、IFAT、ELISA等。但抗體測定難以區(qū)分急性感染和治療后保留的抗體。因病人痊愈后抗體高效價(jià)仍可持續(xù)數(shù)月至數(shù)年。有人采用純化抗體--捕獲夾心ELISA方法檢測糞抗原；采用IFAT、ELISA法、對(duì)流免疫電泳等檢測阿米巴肝膿腫患者的膿標(biāo)本中的阿米巴滋養(yǎng)體，這些檢測對(duì)于臨床診斷、療效考核、預(yù)后判斷均具有重要意義。當(dāng)然，阿米巴抗原的檢測試驗(yàn)還有待于改進(jìn)，以進(jìn)一步提高敏感性和特異性。
　　2.瘧疾：瘧疾的確診需要在血涂片或骨髓涂片中檢查到瘧原蟲。但有時(shí)血中瘧原蟲數(shù)量較少，可能不易查到。因此近些年來，血清學(xué)診斷技術(shù)有不少發(fā)展。如：IFAT、IHA、ELISA等。但主要用于流行病學(xué)調(diào)查。在臨床上常與血檢法配合，對(duì)診斷、追索診斷、篩選供血對(duì)象、防止輸血感染瘧疾等也有一定幫助。(1)抗原檢測，受染的紅細(xì)胞、患者血清含有瘧原蟲及其裂解過程釋放的可溶性抗原。近年來發(fā)展了許多抗原檢測法，特別是惡性瘧原蟲。如凝膠擴(kuò)散法、對(duì)流免疫電泳、IFAT、ELISA、DNA探針斑點(diǎn)雜交、抗原蛋白免疫印跡試驗(yàn)等。ICT既可測惡性瘧抗原，又可測間日瘧抗原。國內(nèi)已應(yīng)用此試劑盒檢測臨床標(biāo)本。(2)抗體檢測，瘧疾患者感染過程中，可產(chǎn)生特異性IgG、IgM、IgA抗體。IgG抗體產(chǎn)生較晚，持續(xù)時(shí)間較長，對(duì)臨床診斷意義不大；IgM抗體產(chǎn)生較早，但在瘧疾復(fù)發(fā)及內(nèi)臟受損的患者，均可再次增高，難以作為初發(fā)病的診斷指標(biāo)。因此抗體檢測一般用于血清流行病學(xué)調(diào)查，也可作為臨床診斷的參考指標(biāo)。方法有IFAT、LAT、IHA、ELISA、斑點(diǎn)酶法等。
　　3.弓形蟲�。汗蜗x病的診斷很大程度上要依靠血清學(xué)試驗(yàn)和尋找病原體�？蓮牟∪搜和科⒐撬柰科�、淋巴結(jié)穿刺、腦脊液沉渣涂片中通過染色、鏡檢查到弓形蟲�？贵w的檢測方法有IHA、LAT、IFAT、ELISA、染色試驗(yàn)、膠體金技術(shù)、IBT等。循環(huán)抗原的檢測方法有LAT、ELISA等。近年來應(yīng)用PCR技術(shù)和DNA雜交技術(shù)檢測弓形蟲DNA，對(duì)診斷也有很大幫助。此外，采取腫大淋巴結(jié)、腦脊液和骨髓等進(jìn)行動(dòng)物接種分離病原體也是弓形蟲病研究中常用的方法。
　　4.肺孢子蟲�。号R床上可以先采取由痰、支氣管灌洗液及肺活檢組織涂片染色法查找病原體。也可以應(yīng)用對(duì)流免疫電泳檢測抗原，但敏感性不高。用IFAT、ELISA、IBT檢測抗體，對(duì)診斷有一定幫助。但因肺孢子蟲肺炎多見于免疫缺陷者，其產(chǎn)生抗體的能力較低。此外，正常人群中也有一定的抗體水平。因此僅靠抗體效價(jià)難于作出診斷。近年來應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)病人痰液、支氣管肺泡液、血液標(biāo)本中的肺孢子蟲DNA進(jìn)行檢測，對(duì)臨床診斷價(jià)值較高。
　　5.隱孢子蟲�。阂话阌杉S便中查找卵囊。由于免疫學(xué)的發(fā)展，單克隆抗體的應(yīng)用，現(xiàn)在多采用IFAT、ELISA和IBT檢測血清中隱孢子蟲抗體。急性期病人血清抗體效價(jià)很高＞1∶40，而正常人一般＜1∶40。此外，使用單抗IFAT和單抗捕獲法ELISA，檢測糞便中卵囊和抗原，在臨床實(shí)踐中具有一定價(jià)值。
　　6.旋毛蟲�。盒x病的病原學(xué)診斷多依靠做肌肉活檢壓片或切片染色法做出�？捎闷ぴ囘^篩，也可用免疫學(xué)方法結(jié)合臨床資料作出判斷。常用的方法有IHA、LAT、IFAT、ELISA、間接過氧化物酶染色試驗(yàn)等來檢測抗體。近年來用單克隆抗體-ELISA或斑點(diǎn)-ELISA檢測血清中的循環(huán)抗原，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。
　　7.絲蟲病：至1994年我國已在全國范圍內(nèi)基本消滅了絲蟲病。后期鑒別因血內(nèi)很難查到少數(shù)微絲蚴，因此血清抗體的檢查是應(yīng)用較多的方法。常用方法為IFA和ELISA。用馬來絲蟲成蟲或微絲蚴抗原作間接熒光抗體試驗(yàn)；用馬來絲蟲可溶性抗原作ELISA檢測患者血清抗絲蟲抗體，敏感性較好。這兩種方法已在國內(nèi)絲蟲病監(jiān)測工作中推廣應(yīng)用。此外，有人采用馬來絲蟲成蟲冰凍切片抗原作免疫酶染色試驗(yàn)，敏感性、特異性均較好；用馬來絲蟲微絲蚴和成蟲排泌抗原作ELISA，診斷班氏微絲蚴血癥者，陽性率也在95%左右。近來有用成蟲可溶性抗原作斑點(diǎn)-ELISA診斷班氏和馬來絲蟲病微絲蚴血癥效果也較好。
　　除檢測抗體外，近來有用單克隆抗體雙夾心ELISA或單克隆抗體斑點(diǎn)ELISA等方法檢測絲蟲循環(huán)抗原；用免疫層析技術(shù)(ICT)檢測班氏絲蟲抗原，敏感性及特異性均很好。既可用于診斷，又可用于考核療效。后者已引用到國內(nèi)使用。
　　8.血吸蟲�。嚎上绕ぴ囘^篩，陽性者再由糞便或腸黏膜活檢組織中檢查蟲卵仍是常規(guī)方法。血吸蟲病的免疫學(xué)診斷試驗(yàn)有許多種。檢測血清抗體最常用的有環(huán)卵沉淀試驗(yàn)、IHA、ELISA及免疫印跡試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)等。但由于患者血清中抗體在治愈后持續(xù)時(shí)間長，不能區(qū)別既往感染與現(xiàn)癥病人，對(duì)藥物療效考核價(jià)值不大。近年來，人們致力于循環(huán)抗原的檢測。方法有單克隆抗體--夾心ELISA、反向間接血凝、單克隆抗體--斑點(diǎn)ELISA等，用來檢測急、慢性血吸蟲病患者，結(jié)果比較滿意。
　　9.肺吸蟲�。悍挝x病主要由衛(wèi)氏和四川(斯氏)并殖吸蟲引起。衛(wèi)氏肺型還是由痰或糞便內(nèi)檢出蟲卵確診。衛(wèi)氏肺外型或四川型常需用的免疫學(xué)檢查方法有：(1)皮內(nèi)試驗(yàn)：可用于過篩，有參考價(jià)值。(2)ELISA：檢測血清中抗體，陽性率可達(dá)98%～100%�？捎糜谠\斷和現(xiàn)場調(diào)查。(3)斑點(diǎn)ELISA或單克隆抗體免疫印跡試驗(yàn)，均可用于檢測血清循環(huán)抗原，可作為早期診斷及療效考核的方法。此外，IFA、IHA、免疫印跡試驗(yàn)等也可用于檢測抗體。
　　10.包蟲�。喊x病的病原學(xué)診斷是由肝或其它部位包囊中抽取的液體沉淀內(nèi)查找棘球蚴頭節(jié)而作出。免疫學(xué)診斷應(yīng)用較多的有：(1)包蟲抗原皮內(nèi)試驗(yàn)(casoni test)：敏感性較高，但特異性相對(duì)較差，不能區(qū)分活動(dòng)性感染和非活動(dòng)性感染，也不能用于考核療效，陰性不能排除包蟲病診斷。(2)ELISA：測定病人血清抗體，敏感性及特異性均較好。(3)循環(huán)抗原檢測：應(yīng)用斑點(diǎn)ELISA、單克隆抗體夾心ELISA等方法檢測，能反映體內(nèi)蟲荷及存活情況，對(duì)抗體陰性者有一定的診斷價(jià)值。
　　11.囊蟲病：囊蟲病特別是腦囊蟲病診斷較為困難�？捎媚蚁x皮內(nèi)試驗(yàn)過篩，再采用患者血清或腦脊液進(jìn)行IHA、ELISA、IFA試驗(yàn)檢測特異性抗體，或采用單克隆抗體ELISA檢測血清和腦脊液中的循環(huán)抗原，對(duì)診斷和療效考核均有一定幫助。必要時(shí)可進(jìn)行皮下結(jié)節(jié)活檢，可以確診。

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