由于殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用,植物病原菌對(duì)殺菌劑抗性問(wèn)題日趨突出,嚴(yán)重影響病害防治的效果。褐腐病是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生和流行的重要果樹病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola為例,基于已知的多菌靈抗性機(jī)理,即靶標(biāo)β微管蛋白基因TUB2的點(diǎn)突變E198A,建立了一種桃褐腐病菌對(duì)多菌靈抗性的等位基因?qū)；訮CR檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明,堿基錯(cuò)配、內(nèi)參引物、退火溫度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、�；砸餄舛燃芭浔鹊纫蛩鼐鶎�(duì)檢測(cè)效率有影響。經(jīng)過(guò)對(duì)以上因素的優(yōu)化,并對(duì)優(yōu)化后的檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行�；约办`敏度評(píng)價(jià),證實(shí)該檢測(cè)技術(shù)能特異性地鑒別桃褐腐病菌M.fructicola對(duì)多菌靈抗性基因型E198A,且檢測(cè)靈敏度可達(dá)到4.342 pg/μL病菌DNA,有望在實(shí)踐中推廣使用。 

【文章來(lái)源】：植物保護(hù). 2020,46(06)北大核心CSCD

【文章頁(yè)數(shù)】：9 頁(yè)

【部分圖文】：

內(nèi)參引物和特異性引物對(duì)多菌靈抗/感菌株的

反應(yīng)體系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑,其質(zhì)量及濃度是影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率以及避免產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增的重要因素。dNTPs的優(yōu)化結(jié)果表明在設(shè)置的各個(gè)濃度梯度下反應(yīng)均能發(fā)生,但特異性引物擴(kuò)增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L濃度擴(kuò)增效率相對(duì)較高(圖4a)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系中推薦的dNTPs濃度為0.2 mmol/L,本著效率優(yōu)先,節(jié)約為輔的原則,確定dNTPs的最佳濃度為0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的優(yōu)化,在不同的Taq DNA聚合酶濃度下反應(yīng)均能發(fā)生,但特異性引物擴(kuò)增的條帶亮度隨濃度增加大致呈依次遞增的關(guān)系(圖4b)。結(jié)果顯示在Taq DNA聚合酶濃度為1.25 U下擴(kuò)增的效率已較高,且接近推薦的濃度,故確定Taq DNA聚合酶的用量為1.25 U(25 μL體系)。圖4 dNTPs (a)和Taq DNA 聚合酶(b)的優(yōu)化

通過(guò)Nanodrop 2000測(cè)定抗性菌株YHC11-8c的DNA濃度為434.2 ng/μL,將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,得到10個(gè)DNA濃度梯度,進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度很高,最低可從稀釋為10-5(4.342 pg/μL)的病原菌DNA中檢測(cè)出抗性菌株,完全可用于生產(chǎn)實(shí)踐(圖7)。圖6 AS-PCR檢測(cè)方法的特異性

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號(hào)：3455937