由于殺菌劑的長期大量使用,植物病原菌對殺菌劑抗性問題日趨突出,嚴重影響病害防治的效果。褐腐病是一種在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生和流行的重要果樹病害。本文以桃褐腐病菌Monilinia fructicola為例,基于已知的多菌靈抗性機理,即靶標β微管蛋白基因TUB2的點突變E198A,建立了一種桃褐腐病菌對多菌靈抗性的等位基因?qū)；訮CR檢測技術(shù)。結(jié)果表明,堿基錯配、內(nèi)參引物、退火溫度、dNTPs、Taq DNA聚合酶、�；砸餄舛燃芭浔鹊纫蛩鼐鶎z測效率有影響。經(jīng)過對以上因素的優(yōu)化,并對優(yōu)化后的檢測技術(shù)進行專化性及靈敏度評價,證實該檢測技術(shù)能特異性地鑒別桃褐腐病菌M.fructicola對多菌靈抗性基因型E198A,且檢測靈敏度可達到4.342 pg/μL病菌DNA,有望在實踐中推廣使用。 

【文章來源】：植物保護. 2020,46(06)北大核心CSCD

【文章頁數(shù)】：9 頁

【部分圖文】：

內(nèi)參引物和特異性引物對多菌靈抗/感菌株的

反應體系中包含dNTPs、Taq DNA聚合酶等試劑,其質(zhì)量及濃度是影響PCR反應的擴增效率以及避免產(chǎn)生非特異性擴增的重要因素。dNTPs的優(yōu)化結(jié)果表明在設置的各個濃度梯度下反應均能發(fā)生,但特異性引物擴增的效率略有不同。0.2～0.3 mmol/L濃度擴增效率相對較高(圖4a)。依據(jù)標準的PCR反應體系中推薦的dNTPs濃度為0.2 mmol/L,本著效率優(yōu)先,節(jié)約為輔的原則,確定dNTPs的最佳濃度為0.2 mmol/L。Taq DNA聚合酶的優(yōu)化,在不同的Taq DNA聚合酶濃度下反應均能發(fā)生,但特異性引物擴增的條帶亮度隨濃度增加大致呈依次遞增的關(guān)系(圖4b)。結(jié)果顯示在Taq DNA聚合酶濃度為1.25 U下擴增的效率已較高,且接近推薦的濃度,故確定Taq DNA聚合酶的用量為1.25 U(25 μL體系)。圖4 dNTPs (a)和Taq DNA 聚合酶(b)的優(yōu)化

通過Nanodrop 2000測定抗性菌株YHC11-8c的DNA濃度為434.2 ng/μL,將DNA分別稀釋為原濃度的100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9,得到10個DNA濃度梯度,進行3次獨立重復試驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該檢測技術(shù)的靈敏度很高,最低可從稀釋為10-5(4.342 pg/μL)的病原菌DNA中檢測出抗性菌株,完全可用于生產(chǎn)實踐(圖7)。圖6 AS-PCR檢測方法的特異性

【參考文獻】：
期刊論文
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博士論文
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本文編號：3455937