病程相關(guān)蛋白(PRs)在植物抗病抗逆過程中發(fā)揮重要作用。鹽穗木病程相關(guān)蛋白基因HcPR10(GenBank:KF673356)來自鹽穗木(Halostachys capsica)在600 mmol·L-1NaCl脅迫下的鹽抑制差減文庫。為探究鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10發(fā)揮生物學(xué)功能的機(jī)制,該研究通過體外表達(dá)和純化HcPR10重組蛋白制備特異性的HcPR10多克隆抗體。并采用雙酶切構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET28a-HcPR10,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichia coli) BL21誘導(dǎo)表達(dá),通過正交分析優(yōu)化重組蛋白可溶性誘導(dǎo)表達(dá)的條件,利用Ni-NTA親和層析柱純化融合蛋白,免疫BALB/c小鼠制備多克隆抗體,基于純化獲得的His-HcPR10重組蛋白和轉(zhuǎn)HcPR10擬南芥總蛋白,分別利用ELISA和Western Blotting檢測抗血清效價和特異性。結(jié)果表明:成功構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a-HcPR10;正交結(jié)果顯示誘導(dǎo)溫度27℃,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)速200 r·min-1,IPTG濃度0.7 mmol·L-1,誘導(dǎo)時間6 h條件下可誘導(dǎo)表達(dá)大量可溶性目的蛋白; ELISA檢測抗H...

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圖2 BL21-pET28a-Hc PR10的原核誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白His-HcPR10的可溶性檢測

高效的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是研究蛋白結(jié)構(gòu)、定位及功能的基礎(chǔ)。本研究的核心目的是純化目的蛋白，制備效價高、特異性好的鹽穗木病程相關(guān)蛋白HcPR10的抗血清。大腸桿菌是最常用的原核表達(dá)系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、遺傳穩(wěn)定、表達(dá)量高、成本低廉、表達(dá)產(chǎn)物易純化及使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)(Nuc&Nuc,2....

圖3 不同誘導(dǎo)條件對BL21-pET28a-Hc PR10可溶性融合蛋白表達(dá)量的影響

圖2BL21-pET28a-HcPR10的原核誘導(dǎo)表達(dá)及重組蛋白His-HcPR10的可溶性檢測圖4His-HcPR10重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化

圖4 His-HcPR10重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化

圖3不同誘導(dǎo)條件對BL21-pET28a-HcPR10可溶性融合蛋白表達(dá)量的影響圖5HcPR10抗血清效價及特異性檢測

圖5 Hc PR10抗血清效價及特異性檢測

圖4His-HcPR10重組蛋白的大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化在最佳條件下誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，用Ni2+親和層析獲得純化的目的蛋白，免疫小鼠獲得HcPR10抗血清，ELISA檢測結(jié)果顯示制備的HcPR10抗血清效價達(dá)1∶243000。抗體對抗原蛋白的專一性是抗體應(yīng)用的關(guān)鍵，本研究提取....

本文編號：4016721