1 文獻綜述

目前，炭疽病已經(jīng)成為草莓種植區(qū)的主要病害，并且在許多國家發(fā)生。自1931 年[29]草莓炭疽病被首次報道以來，已有很多國家對該病的發(fā)生進行了報道，60 年代末日本在德島縣發(fā)現(xiàn)“芳玉”存在該病，同時，巴西、墨西哥、印度等國也有該病報道，80 年代該病迅速擴展蔓延[30]。比利時報道：即使采用殺菌劑進行防治，炭疽病菌引起的果實腐爛仍能容易的造成 25%的損失[24]。美國東南部炭疽病菌導致的根頸腐最高可造成 80%的經(jīng)濟損失，危害范圍廣泛[31]。在我國江蘇、杭州、寧波、上海、建德、西藏等地都有草莓炭疽病普遍發(fā)生的報道，萬瑤等調(diào)查表明杭州下沙和建德地區(qū) 7—9 月份草莓炭疽病的發(fā)病率為 30%左右[32]。草莓感染炭疽菌的癥狀主要表現(xiàn)為果實和根頸腐爛。匍匐莖和葉柄的癥狀主要表現(xiàn)為近黑色的病斑，紡錘形或橢圓形、稍凹陷，病斑可繞匍匐莖和葉柄一圈逐漸擴展，導致病斑以上部位葉片的枯萎和死亡，在高濕條件下，病部可見粉紅色的黏質(zhì)孢子堆，根冠發(fā)病時能導致整個草莓植株死亡，起初是葉片失去生機下垂，逐漸枯死，無病新葉不矮化、黃化或畸變，根部切面從內(nèi)到外變紅褐色，維管束不變色[28]。其他的癥狀包括芽腐、花腐、整個葉片上出現(xiàn)黑色葉斑及葉尖和葉緣出現(xiàn)不規(guī)則的葉斑。

.....

2 膠孢炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑的抗藥性

2.1 材料與方法

用于抗藥性檢測研究的68株草莓炭疽病菌 C. gloeosporioides分別采自浙江省臨安市、建德市和諸暨市設施草莓上的炭疽病病樣，每發(fā)病中心采集 1 個樣本（發(fā)病短縮莖、匍匐莖和葉柄），單獨存放人樣品袋，帶回實驗室分離。采用組織分離法獲得，即用解剖刀從病健交界處切取小塊病組織數(shù)塊大小約5mm×5mm，將病組織放入 1.5%次氯酸鈉溶液中消毒 2min，再經(jīng) 75%的乙醇中消毒 1min 左右，然后用滅菌水漂洗 3 次，除去殘留的消毒劑，最后將其放在無菌吸水紙上吸去多余的水分來減少病組織附近出現(xiàn)的細菌污染，在含有鏈霉素和氨芐青霉素各 50μg/mL 的 PDA 板放 5 塊病組織[85]。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4d，在菌落邊緣挑取單菌絲頂端在 PDA 平板上繼代培養(yǎng) 3～5 次，，得到純化菌株。對純化后的菌株觀察其培養(yǎng)特征，7d 后用無菌水洗下孢子顯微觀察其形態(tài)特征。所有菌株于 4℃下保存于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面上備用。用于后面試驗的葡萄炭疽病菌已由本課題組陳聃前面描述[46]。

2.2 結(jié)果與分析

所采集的草莓炭疽病菌對甲基硫菌靈已經(jīng)產(chǎn)生了普遍的高抗藥性，其中敏感菌株(Ben S)1個，頻率為1.47%，高水平抗藥性菌株（Ben HR）67個，頻率為98.53%，沒有檢測到低水平抗性菌株(Ben LR)和中等抗性菌株(Ben MR) （表2.1，圖2.1）。供試菌株中有 3 種表現(xiàn)型，分別為 Ben S（對甲基硫菌靈敏感），Ben R2（多菌靈.乙霉威雙重抗藥性菌株）。Ben R1（甲基硫菌靈高抗藥性，但對乙霉威敏感）。在不同的溫度（4℃、25℃和 34℃）影響下，三種表現(xiàn)型菌株（Ben S 、Ben R1 和 Ben R2）能夠穩(wěn)定表達，無溫度敏感性變化（表 2.2）。

3 膠孢炭疽菌對吡唑醚菌酯的抗藥性檢測及機制研究................20

3.1 材料與方法......... 21
3.2 數(shù)據(jù)分析處理.............. 24
3.3 結(jié)果與分析.......... 24
3.4 討論..................... 29
4 膠孢炭疽菌抗藥性治理藥劑的篩選......................32
4.1 材料和方法.............. 32
4.2 結(jié)果與分析............. 34
4.3 討論.......... 39
5 膠孢炭疽菌及其抗藥性的 LAMP 快速檢測技術(shù)...........40
5.1 材料與方法............... 40
5.2 結(jié)果與分析..................... 42

5 膠孢炭疽菌及其抗藥性的 LAMP 快速檢測技術(shù)

5.1 材料與方法

膠孢炭疽菌是一種重要的植物病原菌，其分布廣泛、寄主繁多[7,8]，侵染癥狀主要表現(xiàn)為葉片呈凹陷壞死斑，莖、花和果實枯萎腐爛，死苗等癥狀，可造成重要的經(jīng)濟損失。而在20世紀90年代后多菌靈為代表的苯并咪唑類殺菌劑被大量應用，在浙江葡萄和草莓中已經(jīng)檢測到普遍的高抗藥性菌株[9,10]。因此，建立膠孢炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性的快速檢測技術(shù)，用于炭疽病的防治及抗藥性治理具有重要的意義。聚合酶鏈式反應（PCR）為動植物病原菌檢測的重要方法，但需要較昂貴的儀器、試劑與耗材，后期的電泳檢測也費時，致使這一技術(shù)很難在生產(chǎn)一線普及推廣[76]。環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isthermal amplification, LAMP）技術(shù)是由Notomi等在2000年研發(fā)的一種簡便、快速、準確及廉價的核酸高效擴增方法[78]，只需在65℃恒溫條件下反應30 min，即可實現(xiàn)對目標片段進行的大量擴增。在反應中加入鈣黃綠素(Calcein)，若顏色由橙黃色變?yōu)榫G色熒光則說明其中存在被擴增的目標片段。本研究建立了可視化 LAMP 檢測體系，為膠孢炭疽菌對苯并咪唑類殺菌劑抗藥性檢測提供了一種新的手段，同時可為膠孢炭疽菌潛伏侵染的檢測研究提供參考，對于炭疽病害防治和抗病育種尤為重要。

5.2 結(jié)果與分析

恒溫水浴 30min 后，觀察 PCR 管中顏色變化，結(jié)果只以加了膠孢炭疽菌模板的反應管中，顏色由橙黃色變?yōu)闊晒饩G色，即發(fā)生了陽性反應。而以 ddH2O為模板的反應管顏色沒有變化，仍為橙黃色，表明其為陰性反應（圖 5.2-a）。進一步通過 2% 的瓊脂糖凝膠電泳和 EB 染色觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以膠孢炭疽菌為模板的陽性反應擴增產(chǎn)物出現(xiàn)了典型的 LAMP 梯形條帶，而以 ddH2O 為對照的陰性反應中沒有擴增條帶(圖 5.2-b)。說明引物、反應體系和條件符合可視化Tubulin-LAMP 反應。
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6 全文結(jié)論

離體條件下測定了 DMIs 和 QoIs 類中的 5 種殺菌劑對 8 個膠孢炭疽菌菌株菌絲生長的抑制活性，由高到低依次為：咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、戊唑醇、吡唑醚菌酯和嘧菌酯。篩選出咪鮮胺與吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑分別進行復配的兩種藥劑，并進行復配比例的篩選，試驗中所有的比例配方對膠孢炭疽菌的增效系數(shù)（SR）都大于 0.5，未出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象，其中咪鮮胺-吡唑醚菌酯（1:3）和咪鮮胺-苯醚甲環(huán)唑（1:5）表現(xiàn)出了最好的增效作用。建立了可視化的 LAMP 檢測方法，Tubulin-LAMP 檢測技術(shù)具有良好的特異性，不但能區(qū)分膠胞炭疽菌和其它常見病原真菌，并且能特異性檢測出 BenR2 抗藥型膠孢炭疽菌菌株。

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參考文獻（略）

本文編號：98574