第一章  引  言

第一節(jié)  土壤鐵循環(huán)
鐵元素是地殼中的第四豐富的元素，也是重要的活性金屬元素，同時(shí)又是華南地區(qū)土壤里的氧化還原元素（Hauck et al., 2001）。鐵元素以各種類型的氧化物存在，包括磷酸鹽，碳酸鹽，硫化物等各種礦物的形式，在包括土壤環(huán)境中的在各種生境中均有存在（Roden et al., 1996）。在包括河流沉積物和土壤的生境里，重復(fù)進(jìn)行的亞鐵的氧化還原過程形成了一個(gè)不斷運(yùn)動(dòng)的鐵輪，同樣會(huì)推動(dòng)其他相關(guān)物質(zhì)的氧化還原過程。 長(zhǎng)期以來，鐵的氧化和還原過程被認(rèn)為是化學(xué)過程，在 p H 為中性的好氧環(huán)境下，F(xiàn)e(II)的氧化主要由氧氣引起的化學(xué)過程( Lovely et al. 1992)。然而，在厭氧環(huán)境下（如土/水界面），鐵氧化還原過程不是自發(fā)的化學(xué)過程，而是需要有微生物作為介導(dǎo)的。此時(shí)的 Fe(II)的氧化則是由微生物引起的——除了光合型的微生物外，主要是硝酸鹽依賴亞鐵氧化微生物所作用的，乃至少量的微氧型亞鐵氧化菌的作用。這些微生物究竟是如何影響鐵的氧化還原過程進(jìn)而影響到氮循環(huán)的過程，是國(guó)際上一個(gè)比較感興趣的問題。厭氧環(huán)境中三價(jià)鐵還原菌，亞鐵氧化菌通過其自身的酶促反應(yīng)，推動(dòng)著鐵輪的不斷的滾動(dòng)。這類微生物可以將 Fe(II)作為電子供體，本身缺乏充分的產(chǎn)能體系。在有硝酸鹽作為電子受體的避光環(huán)境下，這類微生物將 Fe(II)  （包括 Fe2+，F(xiàn)e(II)-citrate，F(xiàn)e(II)-picolinate，F(xiàn)e(II)-NTA，F(xiàn)e(II)-EDTA 和固態(tài)的 Fe S，F(xiàn)e CO3）氧化成 Fe(III) (Straub et al., 2001; Kumaraswamy et al., 2006; Zhang et al., 2009; Klueglein and Kappler, 2013)；又因?yàn)橥瑫r(shí)具有反硝化和異化硝酸鹽還原成氨的代謝途徑，而成為鐵循環(huán)和氮循環(huán)耦合的聯(lián)系點(diǎn)(Straub et al. 1996; Li et al., 2016)。鐵本身的化學(xué)屬性十分的活潑，在 p H小于 4 的時(shí)候可以在有氧狀態(tài)下保持穩(wěn)定，，但在 p H 大于 5 時(shí)可以自發(fā)的被空氣或者溶液中的氧氣迅速的氧化成 Fe(III)。
.........

第二節(jié)  亞鐵氧化過程及其相關(guān)微生物 
亞鐵氧化作為鐵循環(huán)的重要組成，其作用機(jī)制同樣引起了許多的關(guān)注。亞鐵可以被氧氣進(jìn)行化學(xué)氧化，也可以被微生物所驅(qū)動(dòng)發(fā)生生物氧化。此外，在生物驅(qū)動(dòng)的亞鐵氧化里面，也包括著一些不是酶促反應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)(Klueglein  and Kappler, 2013)。因?yàn)槠駷橹�，許多分離到的亞鐵氧化微生物多是異養(yǎng)型或者混合營(yíng)養(yǎng)型的，這類微生物在還原硝酸鹽時(shí)生成大量的亞硝酸鹽。在酸性 p H 條件下，亞硝酸鹽本身并不是十分的穩(wěn)定，很容易通過化學(xué)反應(yīng)生成其他的代謝產(chǎn)物如二氧化氮和一氧化氮。另外，亞鐵也很容易被這些生成的亞硝酸鹽進(jìn)行化學(xué)氧化。在中性 p H 條件下，即使亞鐵和亞硝酸鹽的反應(yīng)速度比起酸性條件下有所減緩，但二者之間的反應(yīng)仍然十分顯著(Klueglein et al., 2015)。所以，一般認(rèn)為，微生物代謝，即酶促反應(yīng)引發(fā)的亞鐵氧化過程多發(fā)生在 Fe(III)礦物或者是其初產(chǎn)物（如綠銹）上。硝酸鹽的還原需要微生物作為媒介，一旦亞硝酸鹽生成以后，化學(xué)因素所起的因素可能更大。 在厭氧環(huán)境中，亞鐵氧化微生物是整個(gè)亞鐵氧化過程的主要的驅(qū)動(dòng)力。二價(jià)鐵氧化菌中，光合型的細(xì)菌利用光能作為能源，以亞鐵作為電子供體(Kappler et al. 2005)；硝酸鹽依賴型以硝酸鹽作為電子受體，通過還原硝酸鹽獲得能源進(jìn)行生長(zhǎng)。中性和酸性的細(xì)菌則通過把氧氣作為電子受體以獲得能量進(jìn)行代謝。 
............

第二章  三種母質(zhì)發(fā)育的水稻土中性亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原動(dòng)力學(xué)及其微生物機(jī)制 

第一節(jié)  材料和方法
本樣品所采集的水稻土為廣東省廣州市中國(guó)科學(xué)院花崗巖發(fā)育(23°10'38.26" N, 113°21'10.12" E)試驗(yàn)田（Botanical Garden, BG）的新鮮的水稻土（花崗巖發(fā)育），采集的時(shí)間為 2013 年的冬季，水稻田處于抽干狀態(tài)。采集的樣品的深度是水稻土表層以下約 10 cm，放置于 0  ℃冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室的厭氧工作站內(nèi)，1 天后傳代試驗(yàn)開始。另外于 2014 年秋季采集了石灰?guī)r發(fā)育隆安縣南坪鎮(zhèn)三寶村(23.4901° N, 107.64695° E)試驗(yàn)田（Guangxi, GX）的水稻土（石灰?guī)r發(fā)育）。于 2015 年初采集廣東臺(tái)山都斛鎮(zhèn)(22°04'37.54" N, 112°56'59.33" E)最靠近海邊的農(nóng)田（Taishan, TS）水稻土（沉積物發(fā)育）。水稻土的基本理化性質(zhì)如表 2.1 所示。本研究將 1%的水稻土接種在適合硝酸鹽依賴型 Fe(II)氧化微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)體系中，對(duì)水稻土進(jìn)行反復(fù)馴化——即在 Fe(II)已經(jīng)被微生物充分氧化成 Fe(III)氧化物后，吸取十分之一體積的培養(yǎng)物到新配置的培養(yǎng)體系內(nèi)，測(cè)試 Fe、N 和乙酸鹽相關(guān)物質(zhì)的動(dòng)力學(xué)變化，為了使整個(gè)培養(yǎng)體系處于一個(gè)嚴(yán)格厭氧的狀態(tài)，采用高純氮?dú)猓?9.99%）鼓吹至少 30 min，并迅速的壓上橡膠蓋和鋁蓋的方式。所有的西林瓶均放置在恒溫培養(yǎng)箱采用厭氧恒溫培養(yǎng)方法（30  ℃）讓 Fe-N 相關(guān)的微生物在高濃度的亞鐵和硝酸鹽環(huán)境中發(fā)揮其功能。每個(gè)反應(yīng)有 3 個(gè)重復(fù)。 
.........

第二節(jié)  水稻土中亞鐵氧化與硝酸鹽還原轉(zhuǎn)化動(dòng)力學(xué)
本研究模擬了水稻土在中性 p H 厭氧條件下微生物驅(qū)動(dòng)亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原的過程（圖 2.1 和 2.2）。 在花崗巖發(fā)育原始水稻土里，NO3-和 NO2-的濃度不到 0.01  m M，和添加進(jìn)去的NO3-以及生成的 NO2-濃度相比，只能作為一個(gè)背景值存在。水稻土里的 NH4+的濃度可以達(dá)到大約 0.25 m M。NH4+可以被水稻土里的微生物進(jìn)行同化，這導(dǎo)致了 Soil+Fe(II)處理中 NH4+的濃度逐漸下降。在石灰?guī)r發(fā)育和沉積物發(fā)育的水稻土中，NO3-和 NO2-的濃度同樣很低，只是不到 0.01  m M；體系中存在著一定濃度的 NH4+，NH4+的濃度分別約為 0.3 m M 和 0.2 m M。 之前的研究也表明，硝酸鹽還原速率在有 Fe(II)存在的情況下會(huì)有所減緩。微生物對(duì)硝酸鹽還原的代謝路徑分為反硝化路徑  (NO3-→NO2-→NO→N2O→N2)和異化硝酸鹽還原成銨路徑  (NO3-→NO2-→NH4+)  (Weber  et  al.  2006)。硝酸鹽和亞鐵在中性 p H 厭氧的條件下由微生物作用下的反應(yīng)可用以下反應(yīng)式子表示：4Fe(II) + 2NO3- +H+ → 4Fe(III) + NO2- + 3H2O。 在 花 崗 巖 發(fā) 育 水 稻 土 中 ， Soil+NO3-處 理 的 NO3-的 還 原 速 率 比 起Soil+Fe(II)+NO3-處理組要快速。在 4～6 天的時(shí)間里，Soil+Fe(II)+NO3- 和 Soil+NO3-處理的 NO2-的生成呈現(xiàn)一個(gè)快速上升至 3.5～4 m M 然后下降的趨勢(shì)。在這兩個(gè)處理中，均檢測(cè)到有 N2O 的生成。這說明無論是在水稻土體系，或者是梯度稀釋后的純細(xì)菌體系里，NO3-的還原在 Soil+Fe(II)+NO3- 和  Soil+NO3-處理中均有走反硝化途徑，N2O 的生成并不會(huì)受 Fe(II)加入的而造成干擾。同時(shí)，有大約 1 m M 的 NH4+在 Soil+Fe(II)+NO3- 和  Soil+NO3-處理中被檢測(cè)到，表明硝酸鹽還原也走異化硝酸鹽還原成銨的路徑。在第 3 輪和第 4 輪循環(huán)里，NH4+的生成量在 Soil+Fe(II)+NO3-的處理中要小于在 Soil+NO3-的，表明 N 在水稻土體系中的損失可能更多的走反硝化路線。 
.........

第三章  新菌 Rhodocyclaceae sp. Paddy-1 的篩選 ......... 53 
第一節(jié)  材料和方法 ............ 54 
一、菌株 Paddy-1 的分離和鑒定 ......... 54 
二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) ..... 56 
三、理化指標(biāo)檢測(cè)方法 ....... 57 
四、16S r RNA 的 PCR 擴(kuò)增，克隆，序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析............ 57 
五、全基因組測(cè)序方法 ....... 58 
第二節(jié)  新菌 Paddy-1 驅(qū)動(dòng)的 Fe(II)氧化耦合 NO3-還原動(dòng)力學(xué) .... 59 
第三節(jié)  菌株 Paddy-1 驅(qū)動(dòng)的亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原的機(jī)制探討 ..... 65 
一、Fe(II)氧化的相關(guān)基因 .......... 65
 二、NO3-還原的相關(guān)基因 ............ 70 
三、Fe(II)氧化在細(xì)胞上代謝通路的構(gòu)建 ..... 71 
第四節(jié)  本章小結(jié) ....... 72 
第四章 Cupriavidus metallidurans Paddy-2 的篩選......... 75 
第一節(jié)  材料和方法 ............ 76
第二節(jié) Paddy-2 介導(dǎo)的 Fe(II)氧化耦合 NO3-還原動(dòng)力學(xué) ..... 80 
一、Fe(II)氧化動(dòng)力學(xué) ......... 80 
二、NO3-還原動(dòng)力學(xué) ........... 81 
第三節(jié)  生物成礦及其表征 ......... 82 
第四節(jié)  Paddy-2 驅(qū)動(dòng)的亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原的機(jī)制探討 ..... 86 
第五節(jié)  本章小結(jié) ....... 89 

第四章 Cupriavidus metallidurans Paddy-2 的篩選及其亞鐵氧化耦合硝酸鹽還原的機(jī)制探討

鐵在耦合其他元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過程中處于一個(gè)核心的位置(Lehtoranta and Ekholm, 2014)。大量利用 Fe(III)作為電子受體進(jìn)行異養(yǎng)生長(zhǎng)，利用 Fe(II)作為電子供體進(jìn)行化能或光能進(jìn)行異養(yǎng)或自養(yǎng)生長(zhǎng)的微生物已經(jīng)被分離出來(Weber et al., 2006)。水稻土是一個(gè)典型的人工濕地生態(tài)系統(tǒng)，這個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的形成可以歸因于其劇烈的生物地球化學(xué)過程，很大程度上取決于人類活動(dòng)的影響(K?gel-Knabner et al., 2010)。人類對(duì)水稻土的利用是周期性的進(jìn)行作物種植，導(dǎo)致了水稻在不同時(shí)期交替性的產(chǎn)生厭氧-好氧環(huán)境(Ratering and Schnell, 2001)。在稻田的淹水期時(shí)，F(xiàn)e(III)還原產(chǎn)生了大量的 Fe(II)，而在稻田排水后，在氧氣和亞鐵氧化菌的共同作用下被還原的 Fe(II)被重新氧化(Long-Jun et al., 2014)。華南地區(qū)的水稻土中含有較豐富的鐵元素，這類鐵以 Fe(II)或 Fe(III)離子，水鐵礦，纖鐵礦，針鐵礦，施氏礦物的形式存在(Maher et al., 2009)，并且在微生物或者其他理化因素的作用下相互轉(zhuǎn)化。此外，為了促進(jìn)作物的增產(chǎn)，人類往往會(huì)人為的往稻田添加大量的高含氮量的肥料，從而引發(fā)了水稻土里強(qiáng)烈的氮循環(huán)過程。在接近中性 p H 的水稻土環(huán)境中，鐵循環(huán)和氮循環(huán)可以由微生物作為―橋梁‖進(jìn)行耦合。這類微生物中以硝酸鹽依賴型亞鐵氧化菌作為典型，被視為研究這個(gè)機(jī)制的模式生物(Carlson et al., 2012)。 

..........

結(jié)論

從花崗巖發(fā)育水稻土中成功分離到一株具有硝酸鹽還原耦合亞鐵氧化功能的新菌，其 16S r RNA 基因與最接近的 Rhodocyclaceae 科的細(xì)菌只有 94%的相似性，屬于一個(gè)新屬級(jí)別。 菌株在中性 p H 厭氧進(jìn)行 Fe(II)和 NO3-共培養(yǎng) 6 天后約 85%的 Fe(II)被氧化，10  m M  NO3-大約有 93%的被還原，但只有檢測(cè)到 1.2 m M 的 NO2-生成量。NO2-兩個(gè)副產(chǎn)物 N2O 和 NH4+的生成量分別只有約 0.2  m M 和 0.04  m M，表明大量的N 元素進(jìn)入 N2中。Fe(II)的加入使得 NO3-的還原速率和副產(chǎn)物的生成速率均有所減低，表明 Fe(II)對(duì) NO3-的還原起抑制作用。 菌株 Paddy-1 進(jìn)行 Fe(II)氧化生成的礦物是無定型 Fe(III)礦物，無法生成高結(jié)晶度的鐵礦。 通過對(duì)全基因組進(jìn)行測(cè)序，我們得知 Paddy-1 的存在許多 Fe(II)/Fe(III)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（鐵載體和鐵透過酶），以及包括鐵氧化還原蛋白、類黃酮、細(xì)菌鐵蛋白和血紅素在內(nèi)的鐵調(diào)節(jié)蛋白的基因。特別是細(xì)胞內(nèi)擁有 c1、c2、c553 和 c556 等具有捕捉 Fe2+能力的細(xì)胞色素 c，這幾個(gè)細(xì)胞色素 c 和已經(jīng)報(bào)道的 Fe(II)氧化相關(guān)的蛋白非常相似。另外，我們發(fā)現(xiàn)菌株擁有完整的反硝化代謝功能基因鏈。所以我們推測(cè) Fe(II)經(jīng)過 Fe(II)氧化相關(guān)蛋白的傳遞后，被傳遞給硝酸鹽還原酶而完成整個(gè) Fe-N 代謝通路。 
.........
參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：84528