發(fā)布時間：2016-08-04 09:56

第一章 緒論 

1.1 引言 
在自然環(huán)境中，，98%以上的微生物是以附著在固體物質表面的群體性生物膜（Biofilms）形式生長，而不是以單個的浮游態(tài)（planktonic）細胞存在(賈文祥，2012)。微生物膜除了具有菌細胞群體外，還包含粘附于非生物或生物表面由微生物產生的胞外聚合物(主要為胞外多糖，蛋白質和胞外核酸等)組成的復雜三維基質網結構。與浮游態(tài)細菌相比，生物膜形態(tài)的細菌具有以下優(yōu)勢：（1）膜結構的屏障作用使其對環(huán)境的變化具有更強的抵抗能力，如約 60%的人體持續(xù)性細菌感染部位的耐藥性和抗機體免疫反應能力與組織或器官表面的細菌生物膜結構形成有直接關系（Costerton et al., 1999）；（2）生物膜內的細菌代謝強度低，存活時間更長；（3）細胞間可進行密切而廣泛的信息交流和通訊活動。同時，微生物與固體之間的相互作用是一個最基本的生物地球化學過程，對整個地球環(huán)境的變化都有重要影響。例如，微生物與土壤礦物的相互作用，如礦物的溶解、金屬離子還原沉淀、物質交換等，對于表層礦物結構的進化起了關鍵作用。然而，多年來，微生物學家對細菌的認識主要局限于單個浮游態(tài)的細胞研究，而對群體性微生物膜結構及其與固體的界面相互作用的認識則遠遠不足。傳統的微生物膜理論認為，微生物與固體間的相互作用主要包括簡單的吸附/解吸行為、分解礦化、微生物腐蝕、溶解/沉淀等反應過程。伴隨著電活性微生物（Electroactive Bacteria, EABs）的分離和生物膜學（Biofilmology）的發(fā)展，研究者開始認識到微生物與固體間可進行直接的電子交換反應。這一認識極大地吸引了人們對微生物電化學行為的關注和研究興趣，導致了電化學微生物學（Electromicrobiology）、電生物地球化學（Electrobiogeochemistry）等新學科的興起。電活性微生物與固態(tài)電子受體/供體(固體腐殖質、鐵氧化物、電極、天然導電礦物)的相互作用及電子傳遞機制也逐漸成為環(huán)境微生物領域的研究熱點。2010 年 1 月，EST 發(fā)表“Biogeochemical  Redox  Processes”熱點�？�，指出電活性微生物的“胞外呼吸”是厭氧環(huán)境中的控制性電子轉移途徑，直接驅動了 C/N/S 等關鍵元素的生物地球化學循環(huán)過程”。
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1.2  電活性微生物
通常將具有胞外呼吸功能的微生物稱之為電活性微生物。所謂胞外呼吸，是指在厭氧條件下能夠將有機物氧化產生的電子跨膜傳遞至胞外電子受體或電子反向傳遞至胞內的過程。其本質是微生物代謝獲取能量的一種方式。胞外呼吸是相對于傳統的胞內呼吸而言的。胞內呼吸的電子受體（氧、硝酸鹽、延胡索酸鹽等）一般通過擴散等方式進入細胞內，電子傳遞及還原反應在細胞內完成。而胞外呼吸的電子受體（如活性炭、鐵氧化物）通常則不能進入細胞，只能在胞外被還原。故胞外呼吸可看成是細菌電子傳遞鏈延長至細胞膜外的結果。電活性微生物這一概念是近十年來伴隨微生物燃料電池（Microbial  fuel  cells, MFC）的發(fā)展而產生的。不過，早在 20 世紀初，英國植物學家 Potter 發(fā)現酵母和大腸桿菌培養(yǎng)液在降解有機物的同時可以產生電流（Potter et al., 1911）。這一研究首次暗示了電活性微生物的存在，并由此揭開了微生物燃料電池的研究序幕。 MFC 是一種利用微生物胞外呼吸功能將化學能轉換為電能的裝置。電活性微生物是影響 MFC 性能的重要因素。盡管 MFC 已有一百多年的歷史，早期的MFC 由于產電效率低、穩(wěn)定性差而一直處于研究低谷乃至停滯。直到 1980 年以后，各種外源電子傳遞穿梭體（如中性紅、Fe(III)EDTA 等）引入 MFC 后，MFC 產電性能才有了較大的提升(Vega  et  al.,  1987)。然而這些外源電子穿梭體的價格昂貴、容易流失或具有毒性等問題仍然限制了其在 MFC 的應用。2005年，美國學者  Bruce Logan  教授提出將有機廢水處理和微生物發(fā)電的技術相結合，即  MFC 利用廢水中的有機物為底物產生電能的概念，給 MFC 的研究注入了新的活力，引起了國內外學者的高度關注(Logan et al., 2005a)。與其他非生物型燃料電池相比，MFC 最大的特點就是電活性微生物在該過程中發(fā)揮了催化劑的作用，可以取代昂貴的化學催化劑（如鉑等），因而使得該技術具有操作條件溫和、節(jié)省能源、轉化效率高、環(huán)境友好等優(yōu)勢。此外，MFC 的燃料來源具有多樣性。理論上所有可微生物降解的有機物都可作為 MFC 的燃料，MFC 在處理有機廢物的同時產生電能，相比傳統的耗能污水處理工藝可有效降低運行成本，因此利用廢水有機污染物產電具有非常廣闊的應用前景(Logan  et  al., 2005b)。

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第二章 電活性微生物對五氯酚還原脫氯：生物炭介導機制

2.1 引言
生物炭是由生物質(如木材、農作物秸稈、污泥等)在缺氧或無氧的條件下，經高溫慢熱解產生的一類富含碳素的固體材料(Lehmann et al., 2011)。它主要由芳香環(huán)和單質碳或類石墨結構的碳組成，通常含有 60%以上的碳元素。生物炭制備工藝相對簡單，原料來源廣泛，價格低廉，并同時具有多種優(yōu)異的理化特性，包括孔隙多、比表面積大、容重小、吸附能力強、穩(wěn)定性高、偏堿性，因而在全球氣候變化、環(huán)境污染修復、能源短缺、糧食危機和農業(yè)可持續(xù)發(fā)展生態(tài)污染等方面具有潛在的應用價值和前景(Woolf et al., 2010; Ghani et al., 2013)。在過去短短幾年內，生物炭已經成為農業(yè)與環(huán)境科學領域的研究熱點，但主要集中在固碳作用、吸附行為、生物能源、土壤改良劑等方面。例如研究人員估算生物炭可在土壤中保存幾百年乃至幾千年，是極為穩(wěn)定的碳固定載體，將不穩(wěn)定碳轉化為芳香性碳骨架封存于土壤中，有望緩解全球氣候變暖(Singh et al., 2012)。同時生物炭還可抑制溫室氣體的排放(Case  et  al.,  2014)。生物炭可用來作吸附劑去除污水中重金屬和有機污染物，還可作為穩(wěn)定劑鈍化封鎖土壤中污染物(Cao et al., 2011)。將生物炭添加于土壤中可改善土壤的理化性質，從而提高農作物產量(Alburquerque et al., 2013)。生物炭在制備的過程中還可獲得生物質能源及化學品，可以節(jié)省化石能源，并且降低化石原料的碳排放。目前對生物炭應用于土壤后對環(huán)境污染物生物轉化的影響研究仍相對薄弱。 一般認為，碳質材料對污染物的吸附作用降低了其生物可利用性，對污染物起了隔離和封存作用，不利于污染物的降解(Tang et al., 2011)。而材料自身的一些理化性質可能又具有加速吸附態(tài)污染物化學或生物轉化的潛力，使得其對污染物的轉化和命運的影響變得錯綜復雜。例如 Frank 等首先報道活性炭可以作為氧化還原反應電子穿梭體介導并加速污泥微生物對酸性橙和雜氮反應紅的還原降解(Van Der Zee et al., 2003)。生物炭作為新興的一類具有巨大應用潛力的碳質材料，不僅具有與活性炭類似的強大的污染物吸附能力，而且還可以同時具備良好的物理導電性和較多的表面基團，當其廣泛應用后對環(huán)境污染物的生物轉化和命運起著怎樣的作用尚不清楚，仍有待進一步研究。
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2.2 材料和方法 

Geobacter  sulfurreducens  PCA （ DSM12127 ）購買于德國菌種保藏中心（DSMZ）。Geobacter sulfurreducens 初始培養(yǎng)基為 NBAF（p H = 7.0），具體配方見表 2-1 至表 2-4。    實驗所用水稻秸稈 (Rice  straw) 來源于廣州華南植物園稻田，椰子殼(Coconut shell)采集于水果市場。自來水清洗泥土、灰塵等雜質后，將水稻秸稈的穗部、葉子和根部去除，剩下莖稈部分剪成 2-3 cm 長左右的小片段，同時將椰子殼切成均勻小塊，分別放置在烘箱中 80  °C 烘干。將準備好的水稻秸稈和椰子殼分別裝入石英管（長 1.2 m，內徑 7 cm）后，管口密封并通入氮氣（1.5 L/min），然后置于電阻爐上以 20  °C  /min 的速率加熱至某一恒定的溫度（例如900 °C）并維持 1 h。冷卻至室溫后，將所得的炭化固體研磨成約 0.15 mm 大小的碳顆粒，并過 100 目篩子，干燥器中貯存?zhèn)溆�。根據炭化溫度，將不同材料及溫度制備的生物炭分別定名為 BCX（秸稈生物炭）和 YBX（椰殼生物炭），其中 X 代表炭化溫度。例如 BC400 是指 400 °C 炭化的秸稈生物炭。 

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第三章  電活性生物膜對電極電子的吸收及脫氮效果..........57 
3.1 引言 ....... 57 
3.2 材料與方法 ...... 58 
3.3 結果與討論 ...... 66 
3.3.1  糞產堿桿菌和脫氮硫桿菌生物膜的掃描電鏡表征 ......... 66 
3.3.2  糞產堿桿菌和脫氮硫桿菌生物膜的電化學特性 ............. 68 
3.3.3  糞產堿桿菌生物膜對電極電子的吸收及脫氮效果 ......... 71 
3.3.4  脫氮硫桿菌生物膜對電極電子的吸收及脫氮效果 ......... 75 
3.3.5  脫氮硫桿菌的電子輸入機制研究 .... 77 
3.4 本章小結 .......... 80 
第四章  電活性生物膜固定 CO2電合成有機物研究 .............81 
4.1 引言 ....... 81 
4.2 材料和方法 ...... 82 
4.3 結果與討論 ...... 88
4.4 本章小結 ........ 102 
第五章  糞產堿桿菌與固體電極間的雙向電子轉移及機制...........103 
5.1 引言 ..... 103 
5.2 材料與方法 .... 104 
5.3 結果與討論 .... 108
5.4  小結 .... 137 

第五章 糞產堿桿菌與固體電極間的雙向電子轉移及機制 

5.1 引言
電活性微生物胞外電子轉移涉及微生物與胞外氧化還原固體之間的直接電子流動和交換(Yang et al., 2015)。這既包括從細胞內至胞外固體的電子輸出，也包括電子從胞外傳遞至胞內的輸入過程，分別對應于微生物燃料電池的陽極反應和陰極反應。電活性微生物胞外電子的雙向轉移（輸出和輸入）具有同等重要的應用潛力，其電子輸出可用來生產電能、合成金屬納米顆粒、廢水有機物氧化降解等(Logan et al., 2012)。而電子輸入過程則可用于電合成生物燃料、污染物還原降解等(Sharma et al., 2013)。 盡管人們已經從各種環(huán)境中分離了大量不同種類的 EABs，大多數對 EABs電子跨膜傳遞機制的研究主要局限于 G. sulfurreducens 和 S. oneidensis MR-1 等幾種主要模式菌，而對其他 EABs 電子跨膜傳遞機制的認識和研究仍十分不足。更重要的是，這些研究大多偏向于闡明胞外呼吸電子的輸出機制，而胞外電子輸入機制的研究和認識則較為欠缺。研究 EABs 的雙向電子傳遞機制，對于全面理解 EABs 在不同環(huán)境條件的環(huán)境化學行為及效應、提升其應用潛力具有重要意義。 目前 S.  oneidensis  MR-1 的雙向電子轉移機制已經取得了較大進展(Coursolle  et  al.,  2010;  Jiao  et  al.,  2011;  Sydow  et  al.,  2014)。在電子輸出時，S. oneidensis MR-1 采用的是 Mtr 傳遞途徑，呼吸電子依次從 NADH（胞內電子載體）流向甲基萘醌池（menaquinonepool）、Cym A(內膜 c 類型四血紅素基團色素蛋白，c-Cyts)、Mtr A(周質空間 c-Cyts)和外膜跨膜蛋白 Mtr B，最終經外膜 Mtr C和 Omc A 傳遞給胞外電子受體如電極(Yang  et  al.,  2015)。而在電子輸入時，S. oneidensis 菌可以利用逆向的 Mtr  電子傳遞途徑進行胞外電子的吸收和傳遞(Ross et al., 2011; Okamoto al., 2014; Sydow et al., 2014)。但 Geobacter 菌在電子輸入時采用了不同于電子輸出的電子轉移途徑(Strycharz et al., 2011)。 
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結論

本文以四種電活性微生物(硫還原地桿菌、糞產堿桿菌、脫氮硫桿菌和嗜熱自養(yǎng)梭菌)為研究對象，以胞外電子輸出/輸入為主線，分別從五氯酚還原脫氯、硝酸鹽還原脫氮和二氧化碳還原（電合成有機物）等方面研究了微生物與固體電極之間雙向的電子轉移過程及其效應，并探討了其可能的電子轉移機制，得到以下結論： 
（1）秸稈和椰殼生物炭可用作 G. sulfurreducens 生長的電子受體，生物炭電子接受容量越高，G. sulfurreducens 生長量越大。秸稈生物炭能夠發(fā)揮固態(tài)電子穿梭體的功能介導電子從 G.  sulfurreducens 到五氯酚(PCP)的轉移，從而加速PCP 的還原脫氯。但不同溫度制備的秸稈生物炭介導活性差異較大。降解動力學和生物炭表面修飾等結果表明，秸稈生物炭介導 PCP 還原脫氯的活性與其電子交換容量和導電性均有密切關系，證明生物炭以表面氧化還原基團和導電性石墨區(qū)域結構兩種途徑來介導電子從 G. sulfurreducens 到 PCP 的轉移機制。 
（2）A. faecalis 和 T. denitrificans 生物膜均具有吸收碳布電極的電子進行自養(yǎng)脫氮作用的功能。電極電位越負，兩種生物膜的脫氮速率越高。A.  faecalis生物膜的脫氮效率(氮去除率 71.6%)明顯高于 T. denitrificans(氮去除率 17.8%)。前者以脫氮(Denitrification)和異化硝酸鹽還原為氨兩種途徑進行硝酸鹽還原，而后者不存在異化硝酸鹽還原為氨途徑。原位紅外光譜證實 T. denitrificans 外膜氧化還原狀態(tài)發(fā)生了改變，證明其外膜具有電化學活性基團。電子傳遞抑制劑實驗表明 T.  denitrificans 吸收的電極電子跨細菌外膜后傳遞到了質膜上的復合物I、II、III 及醌池，最終傳遞給脫氮酶。在電子傳遞至胞內過程中，T. denitrificans將產生的能量貯存至 ATP。 
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參考文獻(略)

本文編號：84517