1.文獻(xiàn)綜述 

1.1我國(guó)玉米發(fā)展簡(jiǎn)史 
玉米(Zea may L.)原產(chǎn)于南美洲，在美洲已經(jīng)有7000多年的種植歷史。由于玉米適合旱地種植，西歐殖民者侵入美洲后將玉米帶到歐洲，之后在亞洲和歐洲被廣泛種植，大約在十六世紀(jì)中期，中國(guó)開始種植玉米  [1]。 玉米傳入中國(guó)后，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)期主要供作備荒濟(jì)貧而栽培的糧食作物，耕作粗放，品種退化，產(chǎn)量偏低，發(fā)展緩慢。直到20世紀(jì)現(xiàn)代科學(xué)的興起之后，玉米生產(chǎn)才有了較快的發(fā)展。20世紀(jì)中國(guó)玉米生產(chǎn)發(fā)展大致可分為5個(gè)階段[1]：第一階段，1900-1936年，適應(yīng)人口增長(zhǎng)和對(duì)糧食的需要，玉米逐步遍植全國(guó)各地。第二階段，1937-1948年，戰(zhàn)亂頻繁，人口遷徙，生產(chǎn)力遭受破壞。為適應(yīng)戰(zhàn)爭(zhēng)需要，玉米在西南、華北和西北等局部地區(qū)有一定的發(fā)展。第三階段，1949-1978年，隨著人口急劇增長(zhǎng)和滿足糧食需求，玉米作為高產(chǎn)作物被放在重要位置，一般在不適宜種植水稻和小麥的地區(qū)，均大力發(fā)展玉米，形成了我國(guó)南北四季種植的玉米帶。第四階段，1979-1990年，在改革開放的新形勢(shì)下，隨著科技進(jìn)步和物質(zhì)投入的增加，特別是確立玉米在飼料中的主導(dǎo)地位，玉米生產(chǎn)穩(wěn)步發(fā)展。我國(guó)從20世紀(jì)70年代開始在生產(chǎn)上推廣單交種，經(jīng)過五次品種更新?lián)Q代，品種已成為我國(guó)玉米增產(chǎn)的最重要的因素之一。20世紀(jì)中國(guó)玉米研究從無到有、從淺入深、從發(fā)展到提高并取得重大成績(jī)，主要包括品種改良、種質(zhì)創(chuàng)新、耕作栽培、病蟲防治、種子產(chǎn)業(yè)等幾個(gè)方面。20世紀(jì)90年代，玉米發(fā)展成為重要的糧、飼、經(jīng)兼用作物，2012年玉米總產(chǎn)量上已經(jīng)超過稻谷，成為中國(guó)第一大糧食作物。 20世紀(jì)以前，玉米多作為理想的模式植物被用來做遺傳學(xué)研究[2]。1876年達(dá)爾文以自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，首先報(bào)道了自交和雜交對(duì)玉米生長(zhǎng)的顯著差別。1880年W.J. Beal最早用隔離區(qū)和摘除雄穗的方法產(chǎn)生了玉米品種間雜交的種子。Shull進(jìn)行的玉米粒行數(shù)的遺傳研究，揭示了玉米自交系導(dǎo)致衰退、雜交產(chǎn)生生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的現(xiàn)象，并在1908年和1909年發(fā)表文章提出超顯性學(xué)說，從而奠定了近代玉米育種方法的基礎(chǔ)。1918年Jones建議在生產(chǎn)上改用雙交種種子，大大推動(dòng)了玉米雜種優(yōu)勢(shì)在生產(chǎn)上的應(yīng)用。 
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1.2玉米雌穗發(fā)育研究 
在玉米的整個(gè)生育期中，雌穗的發(fā)育對(duì)產(chǎn)量形成尤其重要，對(duì)玉米雌穗的研究不僅有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也有重要的生物學(xué)意義。自十九世紀(jì)中葉開始，到二十世紀(jì)初，除了玉米生理學(xué)和解剖學(xué)方面的研究外，對(duì)有關(guān)花序及小花的個(gè)體發(fā)育的形態(tài)特征，以及對(duì)子房、柱頭、胚珠的形態(tài)解刨等方面的研究，不斷取得進(jìn)展。Kempton 在 1913 年首次明確提出了玉米雌性花序中小穗雙性的問題。Weatheruax 根據(jù)大量玉米變種的觀察，對(duì)雌性花進(jìn)行了詳細(xì)的分析，認(rèn)為玉米的雄花和雌花都是完全花，雌花在母細(xì)胞形成以前保留有發(fā)育不完全的雄性成分，而雄花中雌性成分的退化時(shí)間相對(duì)要早，這也說明了玉米早起發(fā)育階段雄性和雌性小穗的同源性。Bonnet 進(jìn)一步指明了雄穗和雌穗以及小花的發(fā)育過程。在大量參閱國(guó)內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，1978～1981 年，北京農(nóng)林科學(xué)院以京早 7 號(hào)、京早 107 和京黃 113 等品種為試驗(yàn)材料，作不同播期處理，研究玉米雌穗分化過程，，提出了玉米雄雌穗每一時(shí)期的分化過程及形態(tài)特征。 玉米雌穗的分化時(shí)間比雄穗分化較晚，大約晚 10 天左右時(shí)間。其分化過程可分為：生長(zhǎng)錐未伸長(zhǎng)期、生長(zhǎng)錐伸長(zhǎng)期、小穗分化期、小花分化期、性器官形成期。1）生長(zhǎng)錐未伸長(zhǎng)期：生長(zhǎng)錐尚未伸長(zhǎng)，呈現(xiàn)基部寬度大于長(zhǎng)度的圓錐體。生長(zhǎng)錐下面已經(jīng)分化出節(jié)和縮短的節(jié)間，將來成為果穗柄，每節(jié)上有也原始體，以后發(fā)育成包葉。2）生長(zhǎng)錐伸長(zhǎng)期：生長(zhǎng)錐顯著伸長(zhǎng)，長(zhǎng)度大于寬度（圖 1-1），隨后在生長(zhǎng)錐基部出現(xiàn)分節(jié)和葉凸起，在這些葉突起的葉腋間將形成小穗原基，以后葉突起消失。3）小穗分化期：生長(zhǎng)錐繼續(xù)伸長(zhǎng)，出現(xiàn)小穗原基（圖 1-2，1-3），每個(gè)小穗原基又迅速分裂為兩個(gè)小穗突起，形成兩個(gè)并列小穗，并在它的基部出現(xiàn)褶皺狀的突起，將來發(fā)育成穎片。 4）小花分化期：每個(gè)小穗突起進(jìn)一步分化成大小不等的兩個(gè)小花突起。大的在上，生長(zhǎng)較快，發(fā)育成結(jié)實(shí)的小花；小的在下，生長(zhǎng)緩慢，不久萎縮，成為不孕小花。在小花原基外圍，形成三角形排列的三個(gè)雄蕊原基，中間分化出一個(gè)扁圓形隆起的雌蕊原基，隨后雄蕊原基生長(zhǎng)減慢，最后消失，而雌蕊原基迅速增大（圖 1-4，1-5）。 
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2.引言 

玉米目前已是我國(guó)第一大糧食作物，主要用途為糧用、飼用和工業(yè)原料。玉米產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展主要依賴于人們生活水平的提高，玉米在飼料用途上地位的不斷加強(qiáng)，以及國(guó)家對(duì)農(nóng)業(yè)科技的投入的不斷增強(qiáng)。玉米的生產(chǎn)安全在很大程度上也就決定了國(guó)家的糧食安全。而在玉米的生產(chǎn)過程中，玉米植株雌穗的生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)玉米的產(chǎn)量形成具有決定性的作用，研究玉米雌穗發(fā)育及其調(diào)控過程具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生物學(xué)意義。 MicroRNAs（miRNAs）是一類具有 20～24nt 序列長(zhǎng)度的非蛋白質(zhì)編碼的內(nèi)源小分子RNA，這種非編碼 RNA 在動(dòng)物、植物和微生物中高度保守，在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 在動(dòng)植物細(xì)胞的個(gè)體發(fā)育、逆境脅迫、物質(zhì)代謝、發(fā)育調(diào)節(jié)、活性氧清除等生命過程中擔(dān)當(dāng)著重要的角色，相關(guān) miRNA 的基礎(chǔ)研究為人們認(rèn)識(shí)生物基因及其表達(dá)調(diào)控的本質(zhì)提供了一個(gè)全新的角度。隨著 miRNA 研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步以及生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，玉米 miRNA 的分離、靶基因的篩選及功能鑒定等方面的研究成為玉米分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。 目前對(duì)于玉米雌穗的研究多數(shù)集中在玉米授粉后籽粒形成的生理及分子水平上，對(duì)雌穗發(fā)育階段早期的研究較少，在玉米雌穗發(fā)育早期階段，從生長(zhǎng)錐開始形成一直到花器官形成，這一階段的雌穗發(fā)育對(duì)玉米小穗的形成至關(guān)重要。本研究采用降解組測(cè)序的方法，對(duì)玉米雌穗發(fā)育早期階段，從 miRNA 水平，鑒定參與玉米雌穗發(fā)育相關(guān) miRNA 及其靶基因，為進(jìn)一步研究玉米雌穗發(fā)育相關(guān)過程奠定基礎(chǔ)。 
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3.材料與方法 .......... 10 
3.1 主要儀器設(shè)備及耗材 .... 10 
3.2 植物材料和 RNA 的準(zhǔn)備 ....... 11 
3.2.1 實(shí)驗(yàn)樣品總 RNA 的提取 ......... 11 
3.2.2 RNA 質(zhì)量檢測(cè) .... 12 
3.3 全基因組 degradom 測(cè)序 ..... 12 
3.3.1 降解組測(cè)序原理 ....... 12 
3.3.2 降解組測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建 ......... 13 
3.3.3 數(shù)據(jù)分析.... 13 
3.4 miRNA 及靶基因表達(dá)譜構(gòu)建 ...... 14 
4.結(jié)果與分析 .......... 19 
4.1 miRNA 序列基本信息 .... 19
4.2 t-plot 圖 ........ 19 
4.5 新型 miRNA 及其靶基因預(yù)測(cè) ...... 27 
5.結(jié)論與討論 .......... 28 
5.1 結(jié)論 ..... 28 
5.2 討論 ..... 28 

4.結(jié)果與分析 

4.1 miRNA 序列基本信息 

測(cè)序總共得到 175214241 次原始讀數(shù)。每個(gè)樣品平均獲得 19468249 讀數(shù)，范圍從17410285 到 22869631。除篩選接頭序列和短于 18nt 的序列后還有 168052273 次讀數(shù)，每個(gè)樣品平均 18672474 次凈讀數(shù)，范圍從 16909865 到 22244845。所有其他類型的小 RNA 篩除后，還有共138600762 次候選 miRNA讀數(shù)，每個(gè)樣品平均15400084 次讀數(shù)，范圍從11902891到 19538721。候選的 miRNA 與玉米 B73 基因組（RefGen_v2）比對(duì)，在所有的樣品中，21 nt 的 RNA 最豐富，占總量 61.60％；其次是 19nt，占總量 15.51％，這些 miRNA 代表玉米穗成熟的 miRNA 的典型長(zhǎng)度（圖 4）。為了更直觀的展示所檢測(cè)到的 miRNA 相對(duì)于的靶基因的關(guān)系，我們構(gòu)建了玉米雌穗發(fā)育相關(guān) miRNA 與對(duì)應(yīng)靶基因的 t-plot 圖（圖 5）。 玉米雌穗發(fā)育相關(guān) miRNAs 切割靶基因的分類類型 Category 值基本為 0 和 1。zma-miR167a 的靶基因?yàn)?GRMZM2G078274-T03，基因片段長(zhǎng)度為 3199  nt，切割作用發(fā)生在該 mRNA 的第 2542 位上。在該位點(diǎn)上產(chǎn)生的切割片段 reads 數(shù)約為 100 個(gè)，并且 miRNA和靶基因之間的匹配分?jǐn)?shù)為 4，意味著配對(duì)程度很高，幾乎完全配對(duì)，并且是屬于 0 型。zma-miR164a 的靶基因?yàn)?GRMZM2G063522-T01，基因片段長(zhǎng)度 1534nt，切割作用發(fā)生在該 mRNA 的第 905 位上。在該位點(diǎn)上產(chǎn)生的切割片段 reads 數(shù)約為 5 個(gè)，miRNA 和靶基因之間的匹配分?jǐn)?shù)為 2，并且是屬于 1 型。說明原始數(shù)據(jù)片段在該位置，豐度等于該轉(zhuǎn)錄 RNA上的豐度最大值，并且不只一個(gè)豐度最大值。 

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結(jié)論 

利用我國(guó)玉米優(yōu)良雜交種鄭單958的親本自交系昌7-2和鄭58作為試驗(yàn)材料，運(yùn)用降解組測(cè)序等技術(shù)，獲得了玉米雌穗發(fā)育相關(guān)的miRNA及其靶基因。結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）對(duì)玉米雌穗發(fā)育相關(guān)的重要miRNA和其靶基因進(jìn)行表達(dá)分析驗(yàn)證，得到以下結(jié)論： 1.進(jìn)行Illumina測(cè)序后總共得到175214241次原始讀數(shù)。每個(gè)樣品平均獲得19468249讀數(shù)。除篩選接頭序列和短于18nt的序列后還有168052273次讀數(shù)，每個(gè)樣品平均18672474次凈讀數(shù)，范圍從16909865次到22244845次讀數(shù)。所有其他類型的小RNA篩除后，還有共138600762次候選miRNA讀數(shù)，每個(gè)樣品平均15400084次讀數(shù)，范圍從11902891次到19538721次讀數(shù)。候選的miRNA與玉米B73基因組（RefGen_v2）比對(duì)，在所有的樣品中，21 nt的RNA最豐富，占總量61.60％；其次是19nt的片段，占總量15.51％。 2.將targetfinder中miRNA序列與mRNA序列的配對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果和降解組密度文件的結(jié)果相結(jié)合進(jìn)行靶基因的精確預(yù)測(cè)，共發(fā)現(xiàn)16個(gè)miRNA家族的95個(gè)miRNAs對(duì)應(yīng)47個(gè)靶基因。 3.47個(gè)靶基因進(jìn)行了Gene Ontology(GO)分類，發(fā)現(xiàn)處于細(xì)胞核和CCAAT結(jié)合因子復(fù)合體的靶基因占78.5%；參與轉(zhuǎn)錄、DNA依賴、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞分化的靶基因占53.2%；與DNA結(jié)合、特殊序列DNA結(jié)合、金屬離子DNA結(jié)合的靶基因占72.9%。 4.挑選出7個(gè)保守的miRNA及其相應(yīng)的靶基因利用熒光定量PCR的方法進(jìn)行表達(dá)譜的構(gòu)建，顯現(xiàn)出的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果比較一致，表明測(cè)序結(jié)果的可靠性。 5.根據(jù)先前相關(guān)的miRNA的研究報(bào)道，結(jié)合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分析差異表達(dá)明顯的miRNA，表明玉米雌穗發(fā)育過程中存在依賴miRNAs調(diào)控的代謝通路。  
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：63472