第一章 文獻(xiàn)綜述

有許多研究表明了 MI 的含量和多種疾病相關(guān)，例如糖尿病以及糖尿病所引起的腎病、神經(jīng)病和視網(wǎng)膜病等（Bry 和 Hallman 1991；Pfeifer 和 Schumer 1995；Raccahet al. 1998）。研究顯示 MIOX 可能在這些疾病中發(fā)揮作用（Arner et al. 2001）。MIOX 是MI 降解途徑的關(guān)鍵酶，這也就為 MI 的作用提供了證據(jù)。另一個證據(jù)可以從 PtdIns 的研究中獲得，和植物中同樣重要的是 PtdIns 在細(xì)胞膜中的功能，它是細(xì)胞膜磷脂雙分子層的重要組分，具有不可或缺的作用。PIP2在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞移動性以及胞吐作用中具有重要作用（Di Paolo 和 De Camilli 2006；Heck et al. 2007）；PtdIns3P 和 PtdIns（3，5）P2參與細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸途徑；PtdIns（3，4，5）P3可作為原生質(zhì)體膜的信號（Michell 2008）。顯而易見相對于植物，動物中 PtdIns 的研究更為深入，PtdIns 的代謝正逐漸成為研究者對許多疾病進(jìn)行探討的主題。研究顯示，磷脂酰肌醇 4 激酶（PI4K）介導(dǎo) PtdIns 生成磷脂酰肌醇 4-磷酸（PI4P）具有多個同工酶，其功能的障礙，能夠引起精神疾病和神經(jīng)性的疾病（Clayton et al. 2013）。PIP5K 催化 PI4P 生成 PIP2，對小鼠的研究表明類型一的PIP5K（PIP5K1C）能夠調(diào)節(jié)依賴于 PIP2的疼痛信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，或許是治療慢性疼痛的一個目標(biāo)（Wright et al. 2014）。另有研究表明 PIP2在人免疫缺陷病毒（HIV-Ⅰ）的感染中也起重要作用（Rocha-Perugini et al. 2014）。

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第二章 獼猴桃肌醇-1-磷酸合酶、肌醇加氧酶基因克隆及表達(dá)分析

2.1 材料、試劑和儀器

干旱和鹽處理采用的材料：干旱和鹽處理均選取 2 年生美味獼猴桃‘秦美’（Actinidiadeliciosa cv. Qin Mei）幼苗，栽入花盆時進(jìn)行稱重，確保每盆的質(zhì)量一致。每盆栽 1 株，每個取樣時期 5 株作為一個重復(fù)，共重復(fù) 3 次。不同種獼猴桃 MIPS 的比較分析以及 MIOX 分析采用的材料：2012 年于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝訓(xùn)練場 9 年生獼猴桃樹上取樣，共 4 個種，美味獼猴桃‘秦美’（Actinidiadeliciosa cv. Qin Mei）、軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）、山梨獼猴桃（Actinidia rufa），花后每隔 7 或 15 天取樣，在果實(shí)成熟期同時采取莖尖、幼葉、成熟葉、韌皮部、葉柄等組織，所有樣品于液氮中速凍，存于-80℃待用。將至少 10 個果實(shí)（其它組織樣品）作為一個重復(fù)，共重復(fù) 3 次。亞細(xì)胞定位用洋蔥購于市場，擬南芥植株為本實(shí)驗(yàn)室保存。

2.2 試驗(yàn)方法

測序結(jié)果與 NCBI 上的 MIPS 基因序列進(jìn)行比對，并采用生物信息學(xué)軟件 DNAstar、DNAman 對目的序列進(jìn)行分析；通過 Expasy 網(wǎng)站（）上的生物學(xué)軟件對目的序列的理化性質(zhì)（ProtParam）、二級結(jié)構(gòu)（GOR）、三維結(jié)構(gòu)（SWISS MODEL）和親水性（ProtScale）進(jìn)行預(yù)測和分析。對目的序列及其他生物中的 MIPS 氨基酸序列利用 Mega 5.0（Tamura et al. 2011）進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析�；驑尫ㄞD(zhuǎn)化洋蔥表皮參考（Klein et al. 1987）的方法，擬南芥原生質(zhì)體定位參考（Yoo et al. 2007）的方法。pA7 載體酶切位點(diǎn)選擇 SalⅠ和 SpeⅠ。2.2.1.10 MIPS 在美味獼猴桃果實(shí)不同發(fā)育期和不同組織的表達(dá)分析采用上述方法提取 RNA 后，對不同的 RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取 1μg RNA, 采用PrimeScript RT reagent Kit（Takara）試劑盒。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用雙蒸水稀釋到 150 ng/μl。實(shí)時定量表達(dá)分析的引物采用 Primer Premier，version 5.0，software（Palo Alto，CA）設(shè)計(jì)。

第三章 獼猴桃 MIPS 基因干擾對抗壞血酸形成、植株形態(tài)和抗逆性的影響......48

3.1 材料、試劑和儀器........... 48

3.2 試驗(yàn)方法................. 49

3.3 結(jié)果與分析................. 53

3.4 小結(jié)........................ 75

第四章 討論...................................76

4.1 獼猴桃 MIPS 的高度保守性........................ 76

4.2 幼果期是獼猴桃肌醇積累的主要時期................. 76

4.3 獼猴桃 MIPS 受非生物逆境的調(diào)控......... 77

4.4 獼猴桃 MIPS 在各組織中分布的普遍性......... 78

4.5 降低獼猴桃肌醇含量對抗壞血酸含量和抗逆性的影響........... 79

第五章 結(jié)論和主要創(chuàng)新點(diǎn)..........81

第四章 討論

4.1 獼猴桃 MIPS 的高度保守性

肌醇-1-磷酸合酶在細(xì)菌、動物和植物中具有高度的保守性（Johnson 和 Sussex1995；Majumder et al. 1997；Chun et al. 2003；Abreu 和 Arag o 2007；Wongkaew et al.2010）。不同生物的 MIPS 序列相似度很高，都具有 4 個獨(dú)特的保守氨基酸序列：“GWGGNNG”、“LWTANTER”、“NGSPQNTFVPGL”以及“SYNHLGNNDG”。這 4 個序列被認(rèn)為對底物結(jié)合具有重要作用，可能預(yù)示著在進(jìn)化過程中 MIPS 具有催化活性的中心結(jié)構(gòu)是保守的（Majumder et al. 1997）。我們在獼猴桃 MIPS 氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)了這4 個保守的區(qū)段。分析結(jié)果也顯示出獼猴桃 MIPS 氨基酸序列和其它物種 MIPS 序列的高度相似性，表明獼猴桃 MIPS 同樣是一個進(jìn)化上高度保守的蛋白。構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示，獼猴桃屬的 MIPS 蛋白很明顯的聚集在一個分枝，并同其他物種的分枝相區(qū)別。中華和美味獼猴桃并沒有在同一分枝，反而和軟棗獼猴桃的分枝更接近。一些研究者認(rèn)為美味獼猴桃是中華獼猴桃的一個變種，而另一些研究者認(rèn)為它們是獨(dú)立的種。對同工酶和核 DNARFLP 的分析得出的結(jié)論則是美味獼猴桃是異源六倍體，它的一個親本和中華獼猴桃關(guān)系很親近（Liang 和 Ferguson 1984；Testolin 和 Ferguson1997；Mertten et al. 2012）。因?yàn)楂J猴桃的起源和多倍性具有復(fù)雜性，單純的分析 MIPS蛋白還是很有局限性。因此分析美味和中華獼猴桃的分歧，仍需要對更多的的獼猴桃種，更大的基因庫進(jìn)行研究。

4.2 幼果期是獼猴桃肌醇積累的主要時期

雖然我們試驗(yàn)中所檢測的 4 種獼猴桃 MIPS 基因表達(dá)和酶活性存在少量差異，但是這兩個值都在花后 0-15 d 達(dá)到最大值，這個時間普遍比 MI 積累的高峰期略早。這些結(jié)果預(yù)示著 MI 在果實(shí)幼果期達(dá)到最高水平，這與前人的一些結(jié)果相一致（Klages et al.1998；Boldingh et al. 2000；Lorence et al. 2004）。對 MIPS 的基因表達(dá)和酶活性測定進(jìn)一步支持這一結(jié)論。作為 MI 合成途徑的關(guān)鍵酶，MIPS 的轉(zhuǎn)錄水平和酶活性對 MI 含量具有至關(guān)重要的作用。因此 MIPS 基因表達(dá)和酶活性在果實(shí)發(fā)育早期就出現(xiàn)高峰很有可能為這一時期獼猴桃中高的 MI 含量提供基礎(chǔ)。
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第五章 結(jié)論和主要創(chuàng)新點(diǎn)

1. 從美味獼猴桃（Actinidia deliciosa）、毛花獼猴桃（Actinidia eriantha）、山梨獼猴桃（Actinidia rufa）和軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）中克隆獲得 MIPS 基因序列。它們的最大開放閱讀框均為 1533 bp，編碼 510 個氨基酸，，序列比對顯示出高達(dá) 98.94%的相似性。實(shí)時定量 PCR 分析表明，MIPS 基因表達(dá)在獼猴桃 4 個種（美味、毛花、山梨、軟棗）中存在普遍性，并且在果實(shí)發(fā)育的幼果期 MIPS 的表達(dá)量和酶活性都最高。2. 檢測了果實(shí)發(fā)育期 4 種獼猴桃（美味、毛花、山梨、軟棗）可溶性糖含量（MI、蔗糖、葡萄糖、果糖）的變化。結(jié)果表明，MI 含量在美味、毛花和山梨獼猴桃中一直低于其他 3 種糖的含量，而在軟棗獼猴桃中，MI 的含量在幼果期最高，可達(dá)到其他糖類平均值的 6 倍，說明 MI 是軟棗獼猴桃幼果期的主要糖類。軟棗獼猴桃 MI/蔗糖和 MI/（葡萄糖+果糖）的值都高于其它種獼猴桃，這可能是由于其具有較高的從其他糖轉(zhuǎn)化到 MI 的效率。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：59665