發(fā)布時(shí)間：2016-06-21 06:40

第一章  文獻(xiàn)綜述 

1.1 花生概括 
花生，屬蝶形花科，為一年生低矮草本植物，原名落花生（Arachis hypogaea），種子也叫花生米，美名長生果�；ㄉ鞘澜绶秶鷥�(nèi)重要的油料作物之一，中國的花生種植面積為世界第二，年產(chǎn)量則是世界第一位，其經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及營養(yǎng)價(jià)值都非常高，花生的籽仁中含有大量的脂肪、蛋白質(zhì)以及各類維生素等，被稱為“植物肉”�；ㄉ鞍资且环N營養(yǎng)價(jià)值很高的植物蛋白，它含有人們必需的 8 類氨基酸，易被消化、吸收；花生比大豆含有更少的抗?fàn)I養(yǎng)因子，，被認(rèn)為是極有發(fā)展?jié)摿Φ娜樘遣荒桶Y患者的蛋白基料與牛乳等的替代品，尤其是花生中含有豐富的維生素 E，具有延緩人體衰老和增強(qiáng)人體免疫力等作用[1,2]�；ㄉ椭饕煞职柡椭舅幔�20%）和不飽和脂肪酸（80%），其中大量的不飽和脂肪酸亞油酸能夠分解人體內(nèi)的膽固醇并使其分解產(chǎn)物排出體外，避免膽固醇的沉積，從而起到降低膽固醇含量的功效，調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能，對生長和發(fā)育起到促進(jìn)作用[3]，同時(shí)，花生油具有氣味清香，營養(yǎng)豐富，滋味純正的特點(diǎn)，是煎炸食品和烹飪的優(yōu)良油脂，被譽(yù)為是中國的“橄欖油”，有“東方第一油”的美譽(yù)，深受群眾喜愛。多年來，花生油絕對消費(fèi)量呈穩(wěn)中上升趨勢。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，在國內(nèi)作物當(dāng)中，花生種植規(guī)模已經(jīng)位居第七位，而其農(nóng)業(yè)產(chǎn)值則上升到了第五位，與油菜、向日葵、芝麻等油料作物相比，花生的總產(chǎn)、單產(chǎn)、出口量以及產(chǎn)值自 2000 年以來穩(wěn)居世界第一[4,5]，雖然我國花生的生產(chǎn)、出口以及加工形式良好，但目前花生的主推栽培品種老化以及退化嚴(yán)重，品種專用性不突出、遺傳背景狹窄、優(yōu)異種質(zhì)資源匱乏[4,6]，同時(shí)，花生產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性方面凸現(xiàn)的問題也使常規(guī)育種技術(shù)捉襟見肘，例如，對于榨油原料來說，影響其油供給能力與油脂加工等效益的重要指標(biāo)就是種子含油量，研究表明，若榨油原料的含油量提升一個(gè)百分點(diǎn)，則油脂加工純利潤能夠提高 7%[7]。而常規(guī)育種技術(shù)手段已經(jīng)很難再進(jìn)一步提升花生含油量。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷完善，人們已經(jīng)分離克隆了大量的植物功能基因，并闡明其表達(dá)調(diào)控方式與分子機(jī)制，這為花生分子育種提供了可靠的參考，能夠克服當(dāng)今花生育種中存在的難題。 
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1.2 花生油脂代謝機(jī)制研究
當(dāng)前，花生油脂代謝機(jī)制研究主要集中于花生脂肪酸成分的改良以及高油酸形成過程的分子機(jī)理研究。有科研人員從栽培花生中分離兩個(gè)油酰-磷脂酰膽堿Δ12 去飽和酶基因，AhFAD2A 與AhFAD2B，Northern 分析表明：這兩種同源基因在普通的花生中均有表達(dá)，并且證明只有當(dāng) AhFAD2A和 AhFAD2B 基因發(fā)生突變而表達(dá)量顯著降低的情況下，方能導(dǎo)致高油酸突變[8, 9]。Yin 等研究顯示，F(xiàn)AD2 基因表達(dá)水平的降低直接導(dǎo)致其油酸含量從 37%上升到了 70%[10,  11]。禹山林等對輻射育種的高油酸花生品系（O/L 比值約 40）和普通花生品系中的Δ12 脂肪酸脫氫酶基因的序列進(jìn)行了比較，并對兩個(gè)基因編碼區(qū)序列進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變的 AhFAD2B 基因序列有堿基 A 的插入，位置在起始密碼子后第 442bp 處，這導(dǎo)致了編碼區(qū)的提前終止而丟失了一個(gè)膜結(jié)合蛋白保守的組氨酸框[12]。轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)分析顯示，其在普通花生中的表達(dá)量明顯高于高油酸花生中的表達(dá)量[13]。另外，禹山林等通過克隆獲得了五個(gè)花生 PEPC 基因，并證明其在普通花生和高油分花生品種的四種不同組織（根、莖、葉和種子）有差異表達(dá)[14]。周麗俠等人在對魯花 14 等 13 個(gè)花生品種的Δ12 脂肪酸脫氫酶 AhFAD2 基因編碼區(qū)進(jìn)行序列分析研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，該基因在 13 個(gè)花生品種中均存在 3 類轉(zhuǎn)錄本，即 AhFAD2A、AhFAD2B 與假基因[15]。早在上世紀(jì) 30 年代時(shí)，人們就已經(jīng)開始對花生種子貯藏蛋白進(jìn)行研究，人們根據(jù)不同基因型的種子蛋白 SDS-PAGE 的圖譜，將花生球蛋白的組成模式分成 4個(gè)類型，通過分析蛋白的氨基酸組成，發(fā)現(xiàn)花生含有 17 種氨基酸，其中天冬氨酸含量很高，而甲硫氨酸和色氨酸含量較少。通過分析貯藏蛋白的積累模式和基因家族表達(dá)模式，可以篩選高甲硫氨酸蛋白品種[16]。 
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第二章  花生種子不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測序及表達(dá)譜分析 

花生的基因組（約為 2800Mb）要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于水稻的基因組（425Mb）和擬南芥的基因組（128Mb），并且栽培花生是異源四倍體作物且高度自交，其基因組結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，這進(jìn)一步加大了科研人員在分子層面上對其進(jìn)行研究分析的難度。因此，在不能夠全面獲取栽培花生基因組信息的情況下，可以通過轉(zhuǎn)錄組來了解基因組的功能并揭示相關(guān)細(xì)胞組織的分子組成，為在分子層面上深入研究花生含油量和脂肪酸形成機(jī)制起到積極的促進(jìn)作用，本實(shí)驗(yàn)選取遺傳背景相同的高油、低油兩個(gè)極端花生新品系，分別構(gòu)建油脂累積的兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組測序文庫，利用 Solexa 高通量測序技術(shù)，全面獲得花生種子特定發(fā)育時(shí)期的基因序列，并研究兩個(gè)基因型在油脂積累關(guān)鍵時(shí)期的基因功能和基因結(jié)構(gòu)差異，發(fā)掘與高油形成相關(guān)的調(diào)控基因。

2.1  材料與方法 

2.1.1 材料 
實(shí)驗(yàn)材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)花生新品系花 12 和花 606，都是普通型，籽仁大多為橢圓形，連續(xù)開花習(xí)性，株型直立，其中花 12 含油量為 49.6%，花 606 含油量為 57.81%。 
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2.2 結(jié)果與分析 

采用 Yin 等(2011)方法提取花生種子的總 RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果如圖 1，結(jié)果表明，RNA 條帶清晰，沒有拖尾，提取的總 RNA 質(zhì)量很好，比較完整。經(jīng)過分光光度計(jì)檢測，OD260/280均在 1.8-2.0 之間，表明總 RNA 樣品的純度比較好。OD260/230 值在 2.0-2.2 之間，表明提取的 RNA樣品較為純凈，沒有污染。各品種的 RNA 樣品 28S:18S 值均為 2.0，表示所提取的 RNA 樣品完整性很好，沒有發(fā)生明顯降解：將構(gòu)建好的花 U606 種子發(fā)育兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期（30DAF 和 50DAF）和花 U12 種子發(fā)育兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)期（30DAF 和 50DAF）的轉(zhuǎn)錄組測序文庫，運(yùn)用 Illumina HiSeqTM 2000 平臺開展測序，測序得到的原始圖像通過 base  calling 轉(zhuǎn)化為 Raw  reads 序列數(shù)據(jù)。過濾掉含有 adaptor、N 的比例大于 5%和低質(zhì)量 reads 后，總共得到了 53924092 個(gè) reads 的片段，包含有 4853168280 個(gè)核苷酸的序列信息，其中序列片段的長度大于 20 個(gè)堿基的百分比為 98%以上，GC％值平均為 47.73%，說明這 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄組的序列測定結(jié)果都很好，能夠?yàn)楹罄m(xù)的數(shù)據(jù)組裝工作提供準(zhǔn)確的原始數(shù)據(jù).

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第三章  DGAT 基因的序列分析及表達(dá)研究 ......... 28 
3.1 材料與方法 ....... 28
3.1.1 材料 ........ 28 
3.1.2 方法 ........ 28 
3.1.2.1 花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT）基因的獲得 ....... 28 
3.1.2.2 生物信息學(xué)分析 ..... 29 
3.1.2.3  總 RNA 的提取 ...... 29 
3.1.2.4  引物設(shè)計(jì)與合成 .... 29 
3.1.2.5  反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA ........ 30 
3.1.2.6  花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT)基因在種子 ......... 30 
3.2 結(jié)果與分析 ....... 31 
3.2.1 二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT）序列的獲得 ..... 31 
3.2.2 對花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT)進(jìn)行生物信息學(xué)分析 ....... 32 
3.2.2.1 花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)蛋白序列分析 ........ 32 
3.2.2.2 二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)序列比對 .......... 32 
3.2.2.3 二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建 .... 36 
3.2.3 花生 DGAT 基因在種子發(fā)育過程中的表達(dá)分析 ...... 37 
3.3 討論 ..... 39 

第三章  DGAT 基因的序列分析及表達(dá)研究

二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)催化三酰甘油（TAG）合成途徑即 Kennedy 途徑的最后一步，是該途徑唯一的限速酶，其活性位置主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。作為 Kennedy 途徑中最關(guān)鍵的限速酶，二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶（DGAT）在生物體內(nèi)的三酰甘油（TAG）合成過程中起著十分重要的作用，有研究表明，在油料種子發(fā)育過程中，油脂快速積累的同時(shí)二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)的活性也逐漸增強(qiáng)，隨著油脂含量逐步穩(wěn)定，二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)活性也逐漸降低。目前科研人員已經(jīng)對花生中的二   酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)有了一定的研究，如遲曉元等人成功從花生中分離克隆出了 DGAT1 和DGAT3 基因，王龍龍等人通過研究發(fā)現(xiàn)，DGAT1、DGAT2 以及 DGAT3 在花生種子發(fā)育過程中均有表達(dá)，但在不同的時(shí)期表達(dá)量均不相同，推測這三種花生 DGAT 基因可能在種子發(fā)育的不同時(shí)期起主要作用，共同完成花生種子儲存脂類 TAG 的積累。 為探明二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因在花生種子發(fā)育期間對油脂積累的調(diào)控機(jī)制，本研究通過對轉(zhuǎn)錄組測序得到的 5 條花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并通過實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 對花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因在高油份含量花生花 606 和低油份含量花 12 兩個(gè)品種種子不同發(fā)育階段的表達(dá)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究花生二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶(DGAT)基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。  

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結(jié)論

為了揭示在花生種子油脂合成調(diào)控過程中相關(guān)基因的動態(tài)變化，本研究以高油、低油兩個(gè)花生品系的油脂合成初期和高峰期材料為研究對象，采用 Solexa 的高通量測序技術(shù)測序，成功構(gòu)建了花生籽仁早期和中后期 4 個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序文庫，通過分析發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)庫中包含了大量的花生種子中調(diào)控生化代謝的基因，其中有與油脂合成相關(guān)的基因，如脂肪酸合成的調(diào)控基因，亞油酸和亞麻酸合成的調(diào)控基因等。此外，將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析后，也發(fā)現(xiàn)了上述相關(guān)基因的表達(dá)量的變化情況，并且在代謝網(wǎng)絡(luò)中對各個(gè)基因進(jìn)行了調(diào)控定位。依據(jù)代謝通路可以將轉(zhuǎn)錄組中的數(shù)據(jù)分成 126 類，有生化代謝通路，植物一真菌互作，DNA 剪切，植物激素信號傳導(dǎo)，苯丙氨酸生物合成，萜類化合物與類固醇類化合物合成，脂類代謝和 RNA降解等，其中，涉及生化代謝的基因數(shù)量最多，達(dá)到了 7672 條，占整體的 32.95％；其次是植物激素信號傳導(dǎo)的基因有 1493 條，占整體的 6.41％；其中有 4 大類代謝與油脂相關(guān)，分別是脂肪酸代謝途徑，涉及的基因有 145 條，占整體的 0.62％；脂肪酸生物合成途徑，涉及的基因有 85 條，占整體的 0.7％；不飽和脂肪酸的生物合成，涉及的基因有 116 條，占整體的 0.5％；亞麻酸生化代謝，涉及的基因有 138 條，占整體的 0.59％； 對這些差異表達(dá)基因按照代謝途徑歸類，一共得到了 120 多種代謝途徑的信息，其中有 5 種代謝途徑與油脂合成調(diào)控聯(lián)系緊密：不飽和脂肪的生物合成，亞油酸的新陳代謝，亞麻酸的新陳代謝，脂肪酸的生物合成和脂肪酸的新陳代謝。
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參考文獻(xiàn)(略) 

本文編號：59658