第一章  文獻(xiàn)綜述

1  小麥籽粒脂肪氧化酶研究進(jìn)展
小麥?zhǔn)俏覈?guó)主要糧食作物之一，長(zhǎng)期以來，我國(guó)小麥育種以增加產(chǎn)量和提高抗病性為主要目標(biāo)。近年來隨著人們生活質(zhì)量的提高，市場(chǎng)對(duì)優(yōu)質(zhì)小麥的需求量不斷增加，小麥品質(zhì)的遺傳改良越來越受育種家的青睞，品質(zhì)已成為小麥育種和生產(chǎn)的重要目標(biāo)，也是影響產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力的重要因素（何中虎等，2006 和 2011）。面粉顏色性狀是評(píng)價(jià)小麥品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，不僅對(duì)面制品的表觀色澤有重要影響，而且對(duì)其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也具有一定影響（He 等，2004），面粉或其面制品的色澤主要取決于面粉中黃色素、類胡蘿卜素等色素類物質(zhì)的積累（胡瑞波等，2006）。國(guó)內(nèi)外研究表明，小麥籽粒中八氫番茄紅素合成酶（Psy）（He 等，2009；Crawford等，2011）、多酚氧化酶（Ppo）（Baik 等，1995；Chang 等，2007）、脂肪氧化酶（Lox）（汪曉鳴等，2013；Borrelli 等，1999 和 2008）以及一些其它過氧化物酶通過對(duì)色素類物質(zhì)的氧化降解，進(jìn)而影響面粉或面制品的色澤、加工品質(zhì)、磨粉品質(zhì)、儲(chǔ)藏特性等品質(zhì)性狀。 小麥籽粒中的Lox含量很低，但是其在酶促脂肪氧化過程中產(chǎn)生的活性氧不僅能降解色素類物質(zhì)，影響面粉及饅頭、面包和各種面條等面制品顏色（Mares等，2001），而且能影響小麥種子活力、儲(chǔ)藏特性和面粉加工品質(zhì)等（Pastore等，2000；鄭文寅等，2009）。目前，國(guó)外在小麥脂肪氧化酶的生化機(jī)理、結(jié)構(gòu)特征和分子生物學(xué)遺傳分析以及與品質(zhì)性狀關(guān)系等方面已開展了大量的研究。因此，總結(jié)小麥籽粒脂肪氧化酶的測(cè)定方法及其遺傳特征，并重點(diǎn)介紹小麥籽粒Lox活性基因分子生物學(xué)研究概況以及與品質(zhì)性狀的關(guān)系，為國(guó)內(nèi)研究小麥籽粒Lox性狀提供理論依據(jù)，旨在為我國(guó)小麥色澤品質(zhì)的遺傳改良提供參考（張福彥等，2014 a）。因此，通過遺傳育種途徑改良我國(guó)小麥品種色澤相關(guān)性狀，了解小麥脂肪氧化酶基因?qū)ι珴傻男纬蓹C(jī)制對(duì)改良我國(guó)小麥色澤品質(zhì)具有重要現(xiàn)實(shí)意義與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
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1.1  脂肪氧化酶的發(fā)現(xiàn)
1932 年，Andre 和 Hou 首次在大豆中發(fā)現(xiàn)脂肪氧化酶（Lipoxygenase，EC  1.13.11.12，簡(jiǎn)稱 Lox）的存在（Andre 和 Hou，1932）。1950 年，Irvine 和 Winkler 首次在小麥中研究發(fā)現(xiàn)脂肪氧化酶（Lipoxygenase，EC  1.13.11.12，簡(jiǎn)稱 Lox）在面制品加工過程中對(duì)色素類物質(zhì)的氧化降解作用（Irvine 和 Winkler，1950）。隨后又研究了硬粒小麥中的脂肪氧化酶動(dòng)力學(xué)特性（Irvine 和 Anderson，1953）。而 Hsieh 等（1984）利用 CM-纖維素柱層析的方法首次從硬粒小麥胚乳中分離出3 個(gè)有Lox 活性有關(guān)的同工酶，分別命名為lipoxygeanses-1（L-1）、lipoxygeanses-2（L-2）和 lipoxygeanses-3（L-3）。之后，Shiiba 等（1991）利用凝膠過濾和DEAE 離子交換層析法從小麥胚芽中也分離純化出 L-1、L-2、L-3 這三種 Lox 同工酶。進(jìn)一步研究認(rèn)為 L-3 同工酶對(duì)小麥面包烘焙品質(zhì)影響最大（Shiiba 等，1991）。之后，國(guó)外學(xué)者研究表明，脂肪氧化酶是一類不含血紅素鐵或錳的蛋白質(zhì)，專門催化含有順，順-1，4-戊二 烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸的加氧反應(yīng)，生成具有共扼雙鍵的多元不飽和脂肪酸氫過氧化物（Loiseau 等，2001），且在動(dòng)物、植物及微生物中廣泛存在（Brash 等，1999；Feussner 等，2002）。 
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2  脂肪酸氧化酶在其它物種中的研究進(jìn)展

2.1  脂肪酸氧化酶在大麥中的研究概況
Yang 等（1993）發(fā)現(xiàn)大麥中只含有 2 種 Lox 同工酶，分別命名為 Lox-1 和 Lox-2，并利用 CHAP 色譜法從大麥麥芽中分離并純化了 Lox-1 和 Lox-2 同工酶，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) 2種同工酶的分子量非常相近，分別為 90 kDa 和 95 kDa，Lox-1 的最適 pH 為 5.2，而 Lox-2最適 pH 為 6.8，且 Lox-1 主要存在于成熟的種子中，而 Lox-2 主要是在灌漿期和種子萌發(fā)24 小時(shí)以后開始大量表達(dá)（Yang 等，1993）。van Mechelen 等（1995）利用 RT-PCR 和 RACE技術(shù)從大麥中克隆得到 3 個(gè) Lox 全長(zhǎng) cDNA 序列，分別為 LoxA（L35931）、LoxB（L37359）和 LoxC（L37358），Southern 印跡雜交結(jié)果表明 LoxA、LoxB 和 LoxC 在大麥基因組中也屬于單拷貝克隆。Lox-1 和 Lox-2 分別由 LoxA 和 LoxC 基因編碼，同時(shí)利用 AFLP 標(biāo)記將 LoxA和 LoxB 定位于大麥第 4 號(hào)染色體上，且兩者的遺傳距離僅為 1.0 cM，而 LoxC 則被定位于大麥第 7 號(hào)染色體上（van Mechelen 等，1999）。Hirota 等（2005）在大麥中發(fā)現(xiàn) 6 個(gè) Lox-1缺失的突變體，免疫分析表明發(fā)生這些突變的大麥中 Lox-1 蛋白缺失，利用其構(gòu)建的 F2群體進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果表明該突變是由位于 4H 染色體上 LoxA 一個(gè)隱形基因控制，在其結(jié)構(gòu)基因區(qū)域上，發(fā)現(xiàn) 6 個(gè)突變體有類似的特征特性和獨(dú)特的多態(tài)性，推測(cè)認(rèn)為這些突變類型可能起源于同一祖先（Hirota 等，2005）。 
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2.2  脂肪酸氧化酶在大豆中的研究概況
Theorell 等（1947）利用離子交換層析的方法首次從大豆種子中獲得了 Lox-1 結(jié)晶，之后，采用層析法在處于萌發(fā)期的大豆籽粒中先后發(fā)現(xiàn)并分離出 Lox-2、Lox-3、Lox-4、Lox-5和 Lox-6 等 5 種脂肪氧化酶的同工酶（Christoper 等，1970，1972；Kato 等，1992）。Kato等（1992）將先后分離的 Lox-4、Lox-5 和 Lox-6 同工酶與先前研究發(fā)現(xiàn)的 Lox-1、Lox-2、Lox-3 的氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明 Lox-4 與 Lox -1、Lox-2、Lox-3 存在部分同源，但它們之間序列及結(jié)構(gòu)特征又顯著不同。大豆種子中的 Lox-1、Lox-2、Lox-3 分別受 Lx1、Lx2和 Lx3 基因控制，其中 Lx1 基因和 Lx2 基因是二者緊密連鎖，共同控制 Lox 活性性狀，而Lx3 基因則可以獨(dú)立遺傳，，單獨(dú)對(duì) Lox 活性產(chǎn)生影響，且脂肪氧化酶的酶促反應(yīng)與大豆蛋白制品產(chǎn)生的揮發(fā)性氣味和豆腥味的關(guān)系非常密切（Kitamura 等，1985）。利用 RNAi 技術(shù)抑制大豆中Lox 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)已穩(wěn)定遺傳至 T3代的大豆轉(zhuǎn)基因植株中，其籽粒脂肪氧化酶活性及含量顯著降低（馬建等，2009）。Shibata 等（1988）對(duì)大豆種子中 L-1、L-2 和 L-3同工酶結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明 Lox 蛋白中存在 2 個(gè)相對(duì)比較保守的結(jié)構(gòu)域，即：α-螺旋結(jié)構(gòu)和 β-桶狀結(jié)構(gòu)，其中 α-螺旋結(jié)構(gòu)是在 C 末端有一段 40 個(gè)氨基酸組成的保守區(qū)域，其中包含 6 個(gè)組氨酸和 2 個(gè)酪氨酸，主要具有調(diào)節(jié)酶的活性的功能。而 β-桶狀結(jié)構(gòu)與 Ca2+、脂類物質(zhì)的結(jié)合、主要是與酶活性激活、膜的轉(zhuǎn)運(yùn)以及維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有關(guān)（Brash 等，1999）。 
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3  植物 RNA 干擾研究進(jìn)展 ...... 12
3.1 RNA 干擾的發(fā)現(xiàn) ......... 13 
3.2  植物 RNA 干擾機(jī)理及其特點(diǎn) ....... 13 
3.3  植物 hpRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建 ....... 15 
3.3.1  啟動(dòng)子和終止子的選擇 ....... 15 
3.3.2  內(nèi)含子及其它調(diào)控序列 ....... 15 
3.3.3 hpRNA 表達(dá)載體的構(gòu)建方法 ........ 15 
3.4 RNA 干擾的誘導(dǎo)方法 ........... 16 
3.5  植物 RNA 干擾在植物中的應(yīng)用 ............. 16 
4  本研究目的和意義 ....... 18 

3  討論 

3.1 RNAi 載體的構(gòu)建策略 

要將外源目的基因?qū)胧荏w植物中，使之表達(dá)并獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植株，必須借助合適的植物表達(dá)載體以及相應(yīng)的基因表達(dá)調(diào)控元件來實(shí)現(xiàn)，然而 RNAi 表達(dá)載體的構(gòu)建在其理論上和技術(shù)上都相當(dāng)復(fù)雜，其干擾片段的選擇、大小以及在靶基因中的位置等諸多因素，不但會(huì)影響 RNAi 的遺傳轉(zhuǎn)化效率，而且會(huì)影響外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)效率和遺傳穩(wěn)定性（Wianny 等，2000；Holen 等，2003；Lee 等，2011）。 RNAi 表達(dá)載體構(gòu)建過程中基因的表達(dá)調(diào)控原件的選擇對(duì)于構(gòu)建表達(dá)載體的成功與否至關(guān)重要，如：?jiǎn)?dòng)子、終止子、篩選標(biāo)記、O 序列和 poly（A）等一些調(diào)控原件，其中啟動(dòng)子的選擇是決定導(dǎo)入的目的基因在受體植物中表達(dá)的重要因素之一。此外，構(gòu)建表達(dá)載體將啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行加倍，不同啟動(dòng)子串聯(lián)等方法會(huì)對(duì)啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性產(chǎn)生一定的影響。本研究選用中間載體 pSAA003 為 RNAi 表達(dá)載體提供 O 序列和 poly（A）序列，pSAA004 植物表達(dá)載體提供 RNAi 表達(dá)載體所需的 Ubiquitin 啟動(dòng)子、Nos 終止子以及 Bar 基因篩選標(biāo)記。Wesley 等（2001）研究認(rèn)為，植物雙鏈中的發(fā)夾結(jié)構(gòu) RNA（hpRNA）的長(zhǎng)度在 98-853  bp的目的基因反向重復(fù)片段均能夠高效地引發(fā)干擾效應(yīng)，且不會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞死亡。前人研究RNAi 沉默發(fā)現(xiàn)在干擾片段內(nèi)包含目的基因的保守區(qū)域時(shí)，則有可能同時(shí)沉默一簇基因，但其沉默效率和特異性降低，若選擇非保守區(qū)域（一般為功能基因的編碼區(qū)）為干擾片段時(shí)就會(huì)大大提高單個(gè)基因的沉默效率和特異性（Wianny 等，2000）。 

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結(jié)論

1.  來自河南、河北、山東等黃淮海地區(qū)的 163 份不同遺傳背景的普通小麥冬品種（系）的 Lox 活性分布范圍為 49.13-110.77 A234 min?1g?1，說明黃淮海麥區(qū)小麥品種（系）間 Lox活性存在較大差異，變異范圍較為廣泛，具有較大的選擇潛力。Lox 活性基因型與環(huán)境互作的方差分析表明，參試品種（系）的籽粒 Lox 活性在基因型、年份、地點(diǎn)、重復(fù)間、基因型與年份、基因型與地點(diǎn)、年份與地點(diǎn)以及基因型、年份、地點(diǎn)三者之間的差異均達(dá)到極顯著水平，其中小麥籽粒 Lox 活性基因型效應(yīng)最大，其順序依次為：基因型效應(yīng)>基因型與年份互作效應(yīng)>基因型與地點(diǎn)互作效應(yīng)>年份效應(yīng)>基因型、年份、地點(diǎn)三者互作效應(yīng)>年份與地點(diǎn)互作效應(yīng)>地點(diǎn)效應(yīng)>重復(fù)效應(yīng)。此外，小麥籽粒 Lox 活性的廣義遺傳力為 0.75，也間接說明小麥籽粒 Lox 活性很大程度上受遺傳控制。 
2.  對(duì)參試品種（系）的 Lox 活性、蛋白質(zhì)含量、穩(wěn)定時(shí)間、籽粒硬度、白度（L*）、紅度（a*）、黃度（b*）、濕面筋含量以及沉降值等品質(zhì)性狀進(jìn)行分析表明，Lox 活性、蛋白質(zhì)含量等 9 個(gè)品質(zhì)性狀的品種（系）間的差異均達(dá)到極顯著水平，小麥籽粒 Lox 活性與面粉白度（L*）和面粉紅度（a*）呈顯著負(fù)相關(guān)，而與面粉黃度（b*）呈顯著正相關(guān)，但是與蛋白質(zhì)含量、籽粒硬度、濕面筋含量、面團(tuán)穩(wěn)定時(shí)間以及沉降值等品質(zhì)性狀的相關(guān)性很小。蛋白質(zhì)含量與濕面筋、沉降值、面粉紅度（a*）呈極顯著正相關(guān)，其中與濕面筋含量的相關(guān)系數(shù)高達(dá) 0.915，與面粉白度（L*）呈顯著負(fù)相關(guān)。面粉白度（L*）與其它 8 個(gè)品質(zhì)性狀均呈顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；而面粉白度（L*）與面粉黃度（b*）的之間呈極顯著負(fù)相關(guān)，從而說明小麥籽粒 Lox 活性與面粉色澤的關(guān)系更為密切。這些對(duì)了解小麥籽粒 Lox 活性與面粉色澤及蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)性狀的關(guān)系具有一定的參考價(jià)值。 
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參考文獻(xiàn)(略)

本文編號(hào)：56317