第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 類(lèi)胡蘿卜素的種類(lèi)及其功能特性
類(lèi)胡蘿卜素是一類(lèi)由植物和某些光合微生物產(chǎn)生的呈紅色、橘黃色或者黃色的親脂性異戊二烯類(lèi)染料，一般在 300~600nm 之間有吸收峰。類(lèi)胡蘿卜素廣泛存在于食物中，如蔬菜、水果和海鮮類(lèi)等（Polyakov and Kispert 2015）。在自然狀態(tài)下，類(lèi)胡蘿卜素的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是高度不飽和，其最顯著特征為含有 3~15 個(gè)共軛雙鍵（Raisig andSandmann 2001），共軛雙鍵存在的位置決定類(lèi)胡蘿卜素的各種理化性質(zhì)。
1.1.1 類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)

在自然界中已鑒定出天然類(lèi)胡蘿卜素的種類(lèi)超過(guò) 700 種，其中典型的類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)如圖 1-1 所示。由于其種類(lèi)很多，所以分類(lèi)方法也有多種。若類(lèi)胡蘿卜素按長(zhǎng)鏈 C 原子數(shù)量分類(lèi)可分為：C30、C40、C50三大類(lèi)，其中絕大部分類(lèi)胡蘿卜素是 C40類(lèi)，而在甲基桿菌和葡萄球菌等細(xì)菌中會(huì)產(chǎn)生一些 C30類(lèi)（劉曉瑞 2013）。若類(lèi)胡蘿卜素按長(zhǎng)直鏈含有六元環(huán)的數(shù)目分類(lèi)可分為：番茄紅素類(lèi)的直鏈類(lèi)、β-阿樸-8'-胡蘿卜醛類(lèi)的單環(huán)類(lèi)以及 β-胡蘿卜素類(lèi)的雙環(huán)類(lèi)胡蘿卜素。如按照構(gòu)成元素可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是由 C、H 兩種元素組成的環(huán)狀或非環(huán)狀結(jié)構(gòu)的化合物，將其稱(chēng)為胡蘿卜素類(lèi)，這類(lèi)化合物極性較小，典型代表為 β-胡蘿卜素和番茄紅素；一類(lèi)是由 C、H、O 三大元素構(gòu)成的化合物，稱(chēng)之為含氧類(lèi)胡蘿卜素，分子中含有氧原子，可形成羥基、甲氧基、羰基和環(huán)氧化物等（孫玉敬等 2012），極性較大，典型代表為葉黃素類(lèi)（劉曉瑞 2013；Britton 1995）。圖1-1 所示的類(lèi)胡蘿卜素中，β-胡蘿卜素、番茄紅素屬于胡蘿卜素，而 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素屬于含氧類(lèi)胡蘿卜素；番茄紅素屬于直鏈，β-阿樸-8'-胡蘿卜醛屬于單環(huán)，而 β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素屬于雙環(huán)類(lèi)胡蘿卜素。

1.1.2 功能特性
1.1.2.1 光吸收和光保護(hù)作用
在光合生物中類(lèi)胡蘿卜素是不可或缺的組分，有光吸收和光保護(hù)兩方面的作用。類(lèi)胡蘿卜素可捕獲可見(jiàn)光，然后將自身吸收的光能轉(zhuǎn)化為電能，傳遞給葉綠素來(lái)增加光合效率（Cogdell and Thornber 1980），即為光吸收作用；類(lèi)胡蘿卜素以熱的形式釋放出單線態(tài)氧（高度活性）中的能量，從而使其變成基態(tài)氧，對(duì)光合生物有必不可少的保護(hù)作用（張巖巖和陳玉超 2009）。
1.1.2.2 細(xì)胞膜的抗氧化保護(hù)劑

在一些嗜極微生物中，類(lèi)胡蘿卜素多數(shù)位于細(xì)胞膜上，是組成膜結(jié)構(gòu)的主要成分。經(jīng)研究，類(lèi)胡蘿卜素各自特有的結(jié)構(gòu)特征決定了其在細(xì)胞膜上的定位。只由 C、H 兩元素構(gòu)成的胡蘿卜素類(lèi)如 β-胡蘿卜素和番茄紅素等可完全進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部，同時(shí)具有流動(dòng)性；而含氧類(lèi)胡蘿卜素由于其含有極性較大的取代基如羥基，可較大程度地影響類(lèi)胡蘿卜素在膜上的定位。不同的類(lèi)胡蘿卜素可與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)上不同區(qū)域的基團(tuán)起反應(yīng)而作為細(xì)胞膜抗氧化保護(hù)劑，其中胡蘿卜素類(lèi)分子只與細(xì)胞膜的內(nèi)部疏水層上的分子產(chǎn)生有效的反應(yīng)；而含氧類(lèi)胡蘿卜素如玉米黃質(zhì)，由于其極性較大，可穿入極性區(qū)而和水相中存在的自由基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)（Bertram 2004）。

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1.2 類(lèi)胡蘿卜素裂解產(chǎn)物的種類(lèi)及功能
類(lèi)胡蘿卜素除了上述功能外，還可作為一些派生物的重要底物。根據(jù)類(lèi)胡蘿卜素種類(lèi)和裂解位置的不同，可生成多種衍生物，其在生物體中具有重要的功能，如可作為維生素、植物激素及芳香類(lèi)化合物等。具體介紹如下：
1.2.1 維生素 A
類(lèi)維生素 A（視黃醛、視黃醇和視黃酸）是一類(lèi)重要的類(lèi)胡蘿卜素裂解產(chǎn)物，由含有一個(gè)及以上未被取代的 β-末端基團(tuán)的 C40類(lèi)胡蘿卜素或含有 β-末端基團(tuán)和含異戊二烯鏈足夠長(zhǎng)的阿樸類(lèi)胡蘿卜素（如 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛和 β-阿樸-10'-胡蘿卜醛）在 C15-C15'雙鍵位置斷裂生成的化合物（Hoffmann et al. 2012），如圖 1-2a 和 d（Kloer and Schulz2006）。維生素 A 在脊椎動(dòng)物及細(xì)菌的視循環(huán)中有著至關(guān)重要的作用，可促進(jìn)感光蛋白視紫紅質(zhì)的形成（Grote and O'Malley 2011；Spudich et al. 2000）。在動(dòng)物領(lǐng)域，其他的類(lèi)維生素 A 如（3, 4）-二脫氧維生素 A、（3R）-3-OH-維生素 A、（3S）-3-OH-維生素A、（4R）-4-OH-維生素 A 等也可作為視循環(huán)中的發(fā)色團(tuán)（Seki et al. 1998）。當(dāng)類(lèi)維生素 A 含量不足時(shí)，會(huì)引發(fā)視力障礙、角膜軟化及夜盲癥等疾�。ㄚw珺彥和陳啟和 2009）。
所有的反式視黃醇可氧化為反式視黃酸，從而轉(zhuǎn)化為 9-順式異構(gòu)體，這類(lèi)物質(zhì)屬于核視黃酸（RAR）和視黃酸 X（RXR）感受器，因此在免疫缺陷病及癌癥治療中有著重要的作用（Abu et al. 2005；Simeone and Tari 2004；Spilianakis et al. 2005）。另外，維生素 A 還可促進(jìn)食物中鐵元素的吸收，并保持正常的上皮組織形態(tài)和功能，使皮膚保持濕潤(rùn)，避免粗糙、干燥及毛囊角質(zhì)化（Heinrich et al. 2006）。
1.2.2 染料色素

若類(lèi)胡蘿卜素裂解產(chǎn)物保留有較多的共軛雙鍵，則這類(lèi)阿樸-類(lèi)胡蘿卜素可保有原類(lèi)胡蘿卜素色素的性質(zhì)。藏紅花呈現(xiàn)出亮橘紅色的原因主要是（1）C20阿樸-類(lèi)胡蘿卜素藏花酸可降解生成配糖體（圖 1-2a）；（2）C24阿樸-類(lèi)胡蘿卜素胭脂素可生成橘紅色的胭脂紅（圖 1-2c）（Bouvier et al. 2003a）。由圖 1-2c 可知，番茄紅素在 C5-C6和 C5'-C6'雙鍵位置同時(shí)斷裂是合成色素胭脂素（bixin）的第一步（Bouvier et al. 2003a）。所以從胭脂樹(shù)（Bixa orellana）種子中提取得到的胭脂素可廣泛用作食品和化妝品的色素添加劑。

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第二章 巴氏葡萄球菌 TS-82 的特性及其產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的條件優(yōu)化

葡萄球菌在自然界中無(wú)所不在，其中有些種類(lèi)如金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌及表皮葡萄球菌等，存在于食品中，可產(chǎn)生腸毒素（Greig et al. 2007）從而引發(fā)食物中毒（Rodriguez et al. 1996）。之前大部分研究集中關(guān)注于金黃色葡萄球菌的致病性，但是近年來(lái)有報(bào)道表明其他葡萄球菌屬也會(huì)產(chǎn)生致病性（Mounier et al. 2006；Simeoni et al.2008）。所以研究食品源葡萄球菌的致病性是至關(guān)重要的。我們課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)并分離得到一株可以降解類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)香的微生物，經(jīng)鑒定是凝固酶陰性的巴氏葡萄球菌，對(duì)其在液體培養(yǎng)基的研究結(jié)果表明該細(xì)菌產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素降解酶為胞外酶（王樹(shù)林 2011）。因此，為了進(jìn)一步了解該菌產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的能力，以期應(yīng)用于果酒釀造及食品加工中，本章主要對(duì)該菌的特性進(jìn)行研究，，并優(yōu)化篩選出最佳產(chǎn)酶酶活的培養(yǎng)條件。

2.1 材料與方法
2.1.1 材料
2.1.1.1 菌株
實(shí)驗(yàn)室分離保存的巴氏葡萄球菌菌株 TS-82（GeneBank Accession No. KP171185）。
2.1.1.2 主要試劑和儀器
β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品（98%），紅霉素（E），阿米卡星（AM），利福平（RIF），萬(wàn)古霉素（VA），四環(huán)素（TET），氨芐青霉素（AMP），甲氧芐啶（TRI），氯霉素（C），甲氧西林（ME）：Sigma-Aldrich；0.1%（w/v）結(jié)晶紫，新鮮羊血瓊脂培養(yǎng)基，胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，甲苯胺藍(lán)-DNA 酶瓊脂培養(yǎng)基，Baird-Parker 培養(yǎng)基：Solarbio；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?br /> UV-2000 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)：龍尼柯（上海）儀器有限公司；恒溫震蕩培養(yǎng)箱：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH 恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；pH 計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；水平層流單人凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。
2.1.2 方法
2.1.2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

完全營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基：蔗糖 30g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3g/L，調(diào) pH 至 7.0。固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂 20g/L。121℃滅菌 20min 備用。在 37℃、130r/min 條件下培養(yǎng)。

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2.2 結(jié)果與分析
2.2.1 巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性測(cè)試結(jié)果
葡萄球菌廣泛分布于自然界中，包括食品及其周?chē)h(huán)境中。葡萄球菌中的很多種，如金黃色葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌等，能引發(fā)疾病（Rodriguez et al. 1996）。為了檢測(cè)可降解類(lèi)胡蘿卜素巴氏葡萄球菌 TS-82 是否可安全應(yīng)用于食品生產(chǎn)中，對(duì)其主要毒性因素進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果如表 2-1 所示。巴氏葡萄球菌 TS-82 在新鮮羊血（5%）平板上培養(yǎng) 24h 后在菌落周?chē)窗l(fā)現(xiàn)透明溶血環(huán)，表明其為溶血性陰性；TS-82 菌株不能使含有抗凝劑的兔血漿發(fā)生凝固，血漿沒(méi)有發(fā)生改變，表明其為血漿凝固酶陰性；同樣地，TS-82 菌株在胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24h 后未發(fā)現(xiàn)光圈，即未產(chǎn)生蛋白水解酶；TS-82 菌株在甲苯胺藍(lán)-DNA 酶瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng) 24h 后未發(fā)現(xiàn)甲苯胺藍(lán)變色反應(yīng)，表明該菌株不產(chǎn)生 DNA 水解酶；TS-82 菌株在脂肪酶和卵磷脂酶的測(cè)定中未發(fā)現(xiàn)有不透明環(huán)的出現(xiàn)，表明其為陰性；TS-82 菌株可形成弱生物膜（A590=0.24）。以上結(jié)果都顯示 TS-82 菌株未生成與毒素相關(guān)的酶，不具備致病性，可安全用于食品加工工業(yè)。
2.2.2 巴氏葡萄球菌 TS-82 的耐藥性測(cè)試結(jié)果
細(xì)菌致病性的另一個(gè)主要特征是耐藥性。TS-82 菌株在各抗生素的最低抑菌濃度下，37℃培養(yǎng) 24h 后觀察菌體生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)該菌株只在含四環(huán)素培養(yǎng)基上顯著生長(zhǎng)，而在其他抗生素培養(yǎng)基上未生長(zhǎng)，表明 TS-82 菌株只對(duì)四環(huán)素（TET）有耐藥性，而對(duì)其他的抗生素均敏感（表 2-1）。與之前文獻(xiàn)報(bào)道的巴氏葡萄球菌的耐藥性相比（Marino et al.2011），TS-82 的耐藥性明顯低于其他菌株，而且該菌株對(duì)甲氧西林和萬(wàn)古霉素極其敏感，大大提高了該菌株在食品應(yīng)用上的安全性，為該菌株及所產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶作為生物香氣的新型工具奠定基礎(chǔ)。
2.2.3 培養(yǎng)條件對(duì) TS-82 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶活性的影響
2.2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì) TS-82 菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶活性的影響

如圖 2-1 所示，在接種量 2%、37℃、130r/min 條件下，培養(yǎng)時(shí)間對(duì) TS-82 菌株的生長(zhǎng)及產(chǎn)酶酶活均有影響。在培養(yǎng)初期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，菌株呈對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)，酶活較低；在 12~16h 時(shí)菌株基本進(jìn)入穩(wěn)定期，同時(shí)酶活也達(dá)到最大值；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌株 OD 值雖然不再變化，但是大部分菌株逐漸衰亡，產(chǎn)酶量減少，導(dǎo)致酶活下降。因此培養(yǎng)時(shí)間選擇 16h。

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第三章 巴氏葡萄球菌 TS-82 類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的分離純化 ······34
3.1 材料與方法 ·························· 34
3.1.1 材料 ···························· 34
第四章 類(lèi)胡蘿卜素裂解酶酶學(xué)特性的研究 ··············45
4.1 材料與方法 ························ 45
4.1.1 材料 ··························· 45
4.1.2 方法 ··························· 45
4.2 結(jié)果與分析 ························· 48
第五章 類(lèi)胡蘿卜素裂解酶催化不同底物轉(zhuǎn)化為非香氣物質(zhì)的條件及鑒定 ··63
5.1 材料與方法 ···························· 63
5.1.1 材料 ······························ 63

5.1.2 方法 ······························ 64

第六章 類(lèi)胡蘿卜素裂解酶催化不同底物降解產(chǎn)香氣物質(zhì)的測(cè)定及作用機(jī)理的探究

在第五章中提到類(lèi)胡蘿卜素裂解是生成香氣化合物的重要途徑，如 C13酮類(lèi) β-紫羅蘭酮，由于其閾值低至 0.007ppm 而成為風(fēng)味加工中重要的風(fēng)味物質(zhì)（Winterhalter andRouseff 2002），廣泛用于食品加工、飲料飲品制作及化妝品行業(yè)中。同時(shí) β-紫羅蘭酮作為 C13類(lèi)異戊二烯而言還具有一定的生物活性，可抑制癌細(xì)胞增殖、調(diào)控乳腺癌細(xì)胞、抗致畸毒性及降血脂等（孫向榮等 2008；Gurak et al. 2014；Liu et al. 2010）。然而 β-紫羅蘭酮的提取工藝繁瑣、昂貴且量微，所以生物技術(shù)手段在這些香氣化合物的形成上備受關(guān)注，尤其是酶和微生物的生物催化作用（Shimoni et al. 2003）。因類(lèi)胡蘿卜素生物轉(zhuǎn)化生成的香氣化合物是“天然”添加劑而成為生產(chǎn)香氣化合物的重要手段（Uenojo etal. 2007）。類(lèi)胡蘿卜素的生物轉(zhuǎn)化可通過(guò)非特異性氧化或脂肪氧合酶氧化降解（Wu et al.1999），也可通過(guò)過(guò)氧化物酶（Zorn et al. 2003b）或類(lèi)胡蘿卜素裂解氧合酶特異性的催化雙鍵裂解來(lái)實(shí)現(xiàn)（Schwartz et al. 2001）。類(lèi)胡蘿卜素裂解酶可催化許多雙環(huán)及鏈狀類(lèi)胡蘿卜素底物在 C9-C10和 C9'-C10'雙鍵位置斷裂產(chǎn)生一分子的 C14雙醛和兩分子衍生的C13酮類(lèi)（Kloer and Schulz 2006）。由于類(lèi)胡蘿卜素裂解酶廣泛的底物特異性，所以可生成多種 C13化合物，包括 α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、3-OH-β-紫羅蘭酮、3-O-β-紫羅蘭酮、假紫羅蘭酮和香葉基丙酮等（Ilg et al. 2009）。

在上一章中，通過(guò)高效液相色譜及 HPLC-MS 鑒定得到底物裂解生成的非香氣物質(zhì)。通過(guò)非香氣物質(zhì)的信息初步推斷該胡蘿卜素裂解酶作用于類(lèi)胡蘿卜素底物的C9-C10/C9'-C10'雙鍵位置。而文獻(xiàn)報(bào)道類(lèi)胡蘿卜素在 C9-C10/C9'-C10'雙鍵位置斷裂可產(chǎn)生C13酮類(lèi)化合物（Hoffmann et al. 2012），故本章在上一章試驗(yàn)條件的基礎(chǔ)上，通過(guò) GC-MS手段測(cè)定所得純酶催化不同底物裂解生成的香氣物質(zhì)，并結(jié)合生成的香氣物質(zhì)與非香氣物質(zhì)來(lái)準(zhǔn)確探究該類(lèi)胡蘿卜裂解酶的作用位點(diǎn)，揭示其催化機(jī)理。

6.1 材料與方法
6.1.1 材料
6.1.1.1 類(lèi)胡蘿卜素裂解酶純酶的制備
參照 4.1.1.1 的方法制備純酶粉，4℃保存待用。
6.1.1.2 試劑、儀器

β-紫羅蘭酮，β-環(huán)檸檬醛購(gòu)自 Acros-Organics（美國(guó)）；β-阿樸-8'-胡蘿卜醛（98%）、β-胡蘿卜素（98%）、玉米黃質(zhì)（95%）、角黃質(zhì)（95%）、蝦青素（95%）購(gòu)自 Sigma-Aldrich第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望7.1 結(jié)論（美國(guó)）；內(nèi)標(biāo) 3-辛醇購(gòu)自北京百靈威試劑有限公司；丙酮購(gòu)自隴南化學(xué)試劑公司；其他分析級(jí)試劑購(gòu)自天津科密歐。

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第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望

7.1 結(jié)論
類(lèi)胡蘿卜素裂解酶是一類(lèi)對(duì)類(lèi)胡蘿卜素具有催化作用，可將底物轉(zhuǎn)為目標(biāo)產(chǎn)物的生物酶類(lèi)，因具有降解效率高、專(zhuān)一性強(qiáng)、催化條件溫和、產(chǎn)物中目標(biāo)產(chǎn)物含量高的特點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注。類(lèi)胡蘿卜素裂解酶不僅存在于植物、昆蟲(chóng)、哺乳類(lèi)動(dòng)物中，也存在于部分微生物中，如真菌、變形細(xì)菌和光合細(xì)菌等。然而，目前有關(guān)葡萄球菌及其所產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的研究甚少。本課題組在沙棘酒前期發(fā)酵過(guò)程中，分離得到一株高效降解類(lèi)胡蘿卜素的微生物 TS-82，經(jīng)鑒定為巴氏葡萄球菌。為完善類(lèi)胡蘿卜素的降解途徑、開(kāi)發(fā)巴氏葡萄球菌 TS-82 的新功能、揭示類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的催化機(jī)理，論文以高效降解類(lèi)胡蘿卜素的 S.pasteuri TS-82 為對(duì)象，研究其致病性，優(yōu)化培養(yǎng)條件；分離純化類(lèi)胡蘿卜素裂解酶；利用五種底物對(duì)所產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的酶學(xué)特性進(jìn)行了深入、系統(tǒng)的研究；對(duì)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶催化不同底物生成的產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，推斷其作用位點(diǎn)。獲得以下主要結(jié)論：
（1）巴氏葡萄球菌 TS-82 的致病性及培養(yǎng)條件的優(yōu)化。對(duì)巴氏葡萄球菌 TS-82 進(jìn)行毒力因子及藥敏試驗(yàn)得到，該菌不具備致病性，可用于食品加工生產(chǎn)。對(duì)菌株 TS-82的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基為：蔗糖 41g/L，K2HPO41g/L，MgSO4·7H2O0.5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01g/L，KCl 0.5g/L，NaNO33g/L，酵母浸粉 3.7g/L，調(diào) pH 至 7.0；培養(yǎng)條件為溫度 36℃，接種量 2%，培養(yǎng)時(shí)間 16h，在此條件下可提高所產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的酶活。
（2）類(lèi)胡蘿卜素裂解酶的分離純化。上述巴氏葡萄球菌 TS-82 所產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素裂解酶經(jīng) Mono Q 10/100 GL 強(qiáng)陰離子柱、高效制備液相和 Superdex Peptide 10/300 GL 多肽分子篩分離后，可得類(lèi)胡蘿卜素裂解酶純酶；該酶降解 β-胡蘿卜素的比活力為 125U/g，純化倍數(shù)為 446，回收率為 2.39%。經(jīng)高效液相色譜（HPLC）分析，確定該酶為單一峰，純度達(dá)到 95%以上。純化后的類(lèi)胡蘿卜素裂解酶經(jīng) LC-ESI/MS 測(cè)定，得其分子量為655.093Da。

（3）酶學(xué)特性研究。關(guān)于底物特異性，以柱層析純化后的酶為研究對(duì)象，研究結(jié)果表明所得純酶可催化降解 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛、β-胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)、角黃質(zhì)和蝦青素，未檢測(cè)到其體外催化番茄紅素的活性。根據(jù) Lineweaver-Burk 法作圖求得的 Km值和最大反應(yīng)速率 Vmax可知，該酶與五種底物親和力大小排列為：玉米黃質(zhì)>蝦青素>β-胡蘿卜素>角黃質(zhì)>β-阿樸-8'-胡蘿卜醛，底物轉(zhuǎn)化率為：玉米黃質(zhì)>角黃質(zhì)>蝦青素>β-胡蘿卜素>β-阿樸-8'-胡蘿卜醛。關(guān)于酶學(xué)特性，該酶對(duì) C40類(lèi)胡蘿卜素底物的最適溫度為 60℃，而作用于 β-阿樸-8'-胡蘿卜醛的最適溫度是 50℃，該酶的穩(wěn)定溫度為 50℃以下；該酶對(duì)文中考察底物的最適 pH 為 3.0；Al3+和 Fe3+是該酶的強(qiáng)效催化劑，F(xiàn)e2+是該酶的強(qiáng)效抑制劑，在 1mM 的情況下就可使該酶幾乎完全失活；H2O2在低濃度范圍內(nèi)（0~16mM）可促進(jìn)酶活；低濃度乙醇（0~16%）的添加對(duì)酶活影響不大，無(wú)抑制作用。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：44071