【摘要】：特異腐質霉具有強大的纖維素降解和纖維素酶分泌能力,因此在生物質能源、釀造工業(yè)、紡織工業(yè)及高效外源基因表達等領域具有良好的應用前景。但目前對該菌的研究多停留于胞外酶的純化和相關酶基因的克隆表達,關于其成熟表達系統(tǒng)的研究卻鮮有報道。本研究以特異腐質霉Y1為出發(fā)菌株,利用根瘤農桿菌介導的轉化方法,成功構建了該菌的高效遺傳操作體系。利用內源3-磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子元件實現(xiàn)了外源基因,包括G418和潮霉素B的抗性基因,以及增強型綠色熒光蛋白編碼基因在特異腐質霉中的功能性表達。利用纖維二糖水解酶NCE2啟動子元件,成功實現(xiàn)了特異腐質霉HiBgl3A和Talaromyces leycettanus JCM12802 TeBgl3A在特異腐質霉中的分泌性表達。同時,我們對轉化參數(shù)進行了優(yōu)化,最終實現(xiàn)了超過300個轉化子/106分生孢子的轉化效率。在此基礎上,利用T-DNA隨機插入突變的方法建立了特異腐質霉的突變體庫,并從中篩選得到了纖維素酶高產突變株T4。突變株T4的濾紙酶活、內切β-1,4葡聚糖酶酶活、纖維二糖水解酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力以及木聚糖酶活較野生型菌株均有了大幅度提升,分別提高了60%,440%,320%,41%和81%。繼而通過克隆鑒定該突變株中T-DNA插入位點的側翼序列,獲得了兩個與纖維素酶表達分泌可能相關的基因tdiD和proA。本研究為我們改良特異腐質霉菌株,優(yōu)化纖維素降解酶系,使其成為高溫中性纖維素酶的工業(yè)生產菌株奠定了良好基礎,還可為實現(xiàn)異源基因在特異腐質霉的高效表達提供必要的技術保障。此外,我們還克隆鑒定了特異腐質霉中新型內切β-1,4-葡聚糖酶編碼基因Hicel6C和β-1,3(4)-葡聚糖酶編碼基因Hicel16A,成功實現(xiàn)了其在畢赤酵母中的異源表達,并對重組蛋白的酶學性質進行了研究分析。與大多數(shù)真菌來源的酸性內切葡聚糖酶不同,重組HiCel6C最適作用pH為6.5,具有較好的耐堿性,在pH8.0時仍具有98%的相對酶活力,在pH 9.0和10.0時,仍有61.2%和27.6%的相對活力。在pH 5.0-11.0的范圍內,都具有良好的pH穩(wěn)定性,37℃處理1 h后,仍保留80%以上的酶活力。HiCel6C最適反應溫度為70℃,具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性,60℃處理1h后,仍保留90%以上的酶活力。在70℃,pH 6.5條件下,以大麥葡聚糖為底物時,HiCel6C的Km值和Vmax分別為1.29 mg/mL和752μmol/min·mg。HiCel6C可以降解大麥葡聚糖、地衣多糖和羧甲基纖維素鈉,卻對昆布多糖無降解活性,表明其特異性的切割β-1,4-糖苷鍵。HiCel6C隨機切割纖維寡糖內部的糖苷鍵,是一個典型的內切酶。HiCel6C的這些優(yōu)良性質使其在許多應用領域,如生物質能源轉化、紡織、啤酒釀造和造紙工業(yè)等領域都具有重要的應用價值。Hicell6A成熟cDNA全長861 bp,編碼了286個氨基酸和一個終止密碼子。HiCel16A包含一個N端20個氨基酸的信號肽序列和一個保守的GH16家族的催化結構域。我們成功實現(xiàn)了HiCel16A在畢赤酵母GS115中的異源表達。重組HiCel16A可以降解大麥葡聚糖、地衣多糖和昆布多糖,卻對羧甲基纖維素鈉無降解活性,表明其HiCel16A是一個β-1,3(4)-葡聚糖酶。這是特異腐質霉中第一個得到功能鑒定的β-1,3(4)-葡聚糖酶。重組HiCel16A最適作用pH為5.5,最適反應溫度為55℃。與大多數(shù)特異腐質霉來源的纖維素酶和半纖維素酶類似,重組HiCel16A在中性偏堿(pH 5-9)范圍內具有較好的穩(wěn)定性,37℃處理1 h后,仍保留90%以上的酶活力。在55℃,pH 5.5反應條件下,以大麥葡聚糖為底物時,HiCel16A的Km值和Vmax分別為0.91 mg·ml-1和1530 μmol·min-1·mg-1。 HiCel16A的優(yōu)良酶學性質使其可以廣泛應用于多種領域,如近年來報道的應用降解混合糖苷鍵的β-葡聚糖酶水解大麥和地衣生產生物燃料,應用β-1,3-葡聚糖酶防治植物的真菌病害等。
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Ｗｅｓｔ知ｅｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１0。被氧化物的出現(xiàn)明這是一種新型纖維素降解制。逡逑此外，還有一些真菌酶系組分也參與到纖維素的降解中。例如，刪除粗糖逡逑脈抱菌中纖維二糖脫氨酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅ－ｄ濁ｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，邋ＣＤＨ）編碼基因Ｃ誠ｉ－ｉ時，逡逑纖維素酶活力大幅下降。ＣＤＨ促進作用的發(fā)揮與ＧＨ６１蛋白的存在有關，這是逡逑一種與褐腐真菌中氧化還原酶通過產生徑自由基攻擊纖維素所不同的、直接由逡逑氧化酶作用于底物的纖維素氧化降解機制（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ邋ｅｔ邋ａｌ．，２０１１）。向里氏木霉酶系逡逑中加入重組的ＣＤＨ時，葡萄糖磨酸的釋放和半纖維素的降解得到促進（Ｂｅｙ邋ｅｔａｌ．，逡逑２０１１）。被命名為ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ的蛋白與纖維素酶也具有協(xié)同水解作用（Ｗａｎｇ邋ｅｔ邋ａｌ．，逡逑２０１１）。Ｓｗｏｌｌｅｎｉｎ具有典型的纖維素酶結構域組成模式及轉錄調控特化可使微逡逑晶纖維素粒徑變小，，但檢測不到還原糖的產生（Ｇｏｕｒｌａｙ邋ｅｔ邋ａｌ．，邋２０１３；邋Ｓａｌｏｈｅｉｍｏ邋ｅｔ逡逑ａｌ．，２００２）。纖維素醇中的纖維素結合結構域在單獨存在時，也可Ｗ通過改變結晶逡逑巧維素結構來促進后續(xù)的纖維素酶水解（Ｈａｌｌ邋ｅｔ邋ａｌ．，２0ｎ）。逡逑ｂｅｔａ邋續(xù)邐戶‘顆—？逡逑

我們檢測了潮霉素Ｂ和Ｇ４１８對特異腐質霉在ＰＤＡ培養(yǎng)基中生長情逡逑況的影響。實驗結果表明，ｄＯ帖／ｍＬ的潮霉素Ｂ和＾０帖／ｍＬ的Ｇ４１８可Ｗ逡逑完全抑制將異腐質霉的生長（圖２－１邋）。因此，潮霉素Ｂ抗性基因（�。粒┖停牵矗保稿义峡剐曰蚓勺鳛樘禺惛|霉外源基因轉化的篩選標記。逡逑Ｇｒｏｗｔｈ邐＋？？邐？？邐？邐－邐－逡逑０邐，邋．１化ｕｇ＇ｍｌ邐說倆？晵巧啼Ｉ。三戶奶巧竹ｆ。山－逡逑ＰＤＡ＋Ｇ邋州邋ｅｔｉｃｉｎ邐ｉ逡逑說州邋＇．’，Ｓ邐－邐５的／ｍｌ邐１巧Ｓ巧＇Ｔｉｌ邐

本文編號：2565941