第一章 緒論

1.1 靈芝的資源分布研究概況
靈芝多糖主要是從野生靈芝或人工栽培靈芝的子實體、孢子粉和靈芝菌深層發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)物菌絲體和發(fā)酵液中提取得到。多糖類物質(zhì)是一類含有多羥基的化合物，主要包括糖脂、糖蛋白、蛋白聚等。多糖類物質(zhì)提取原理是根據(jù)其易溶于水中、稀堿、稀酸中，而不易溶于乙醇乙醚等有機(jī)溶劑中的特性來進(jìn)行提取分離。比較常用的方法是水提法、堿提法，提取的時間不能太長，以防止多糖水解。可以在提取多糖前使用乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑浸泡靈芝子實體，這樣可以去除樣品中脂類的物質(zhì),并分解多糖的酶活性,以防止提取多糖過程中發(fā)生降解[8]。

提取多糖時還要除去樣品中含有的蛋白質(zhì)和其它的小分子物質(zhì)。大部分的多糖不易在有機(jī)溶劑中溶解，可以使用乙醇進(jìn)行多次的沉淀，最終可以提取出粗多糖。粗多糖中游離的蛋白質(zhì)可用 Sevage 法去除[9]，將粗多糖溶于水中，以 4：1 三氯甲烷正丁醇混合，搖晃均勻。使用振蕩器將三氯甲烷正丁醇混合液震蕩至蛋白質(zhì)變性，在乳化層中去除蛋白質(zhì)，重復(fù)操作，直至有機(jī)層呈現(xiàn)澄清狀態(tài)。在蛋白中的雜質(zhì)清除之后，再用透析法除去小分子的雜質(zhì)，最后使用乙醇沉淀多糖，既得到靈芝總多糖。羅立新等[10]采用冷熱水、利用冷熱堿液提取的方法，對靈芝子實體和菌絲體中的多糖進(jìn)行提取，使多糖得到初步分級。根據(jù)料液比、提取溫度、提取次數(shù)、提取時間等因素，對靈芝多糖提取各水平進(jìn)行分析，最終選取最佳提取工藝，并對多糖進(jìn)行了層析純化，使多糖的純度達(dá)到 96%以上。李堅等[11]使用紫外分光光度計以苯酚硫酸顯色法在 490nm 處測定靈芝多糖的含量，得出試驗結(jié)果，目前使用的苯酚硫酸法測定靈芝多糖含量數(shù)據(jù)比未改進(jìn)前更為準(zhǔn)確可靠。趙陽楠等[12]用苯酚硫酸法和間接碘量法，分別測定了同一供試品靈芝多糖的含量。得出結(jié)論，兩種方法測定總糖含量基本一致。

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1.2 靈芝的主要活性成分
靈芝的化學(xué)成分較為復(fù)雜，從各靈芝屬中分離出 150 余種化學(xué)成分。主要可分為：多糖類、呋喃類衍生物、核苷類、甾醇類化合物、氨基酸蛋白類、三萜類、生物堿類、油脂類、有機(jī)鍺、無離子等[3]。靈芝在我國已有多年的歷史。作為食藥用真菌，在食用的過程中既有營養(yǎng)價值又有較高的藥用價值。近些年來，靈芝的開發(fā)與利用越來越受到更多人的關(guān)注。靈芝的種類眾多，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，人們不單方面只對靈芝進(jìn)行研究，而是深入到靈芝的各個層面去研究，以求發(fā)現(xiàn)靈芝更多的用途。
靈芝三萜類化合物是一種具有較高脂溶性的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)也較為復(fù)雜，高建莉等[13]對靈芝三萜類進(jìn)行了研究，得出結(jié)論：靈芝中的三萜類化合物是靈芝的特殊有效成分，大多數(shù)具有苦味，依據(jù)分子中所含的碳原子數(shù)不同，可分為 C30，C27，C24 等三種。從不同的結(jié)構(gòu)來看，靈芝三萜類化合物還可以分為靈芝酸，靈芝醇，靈芝酸甲酯，靈芝孢子酸，赤芝孢子內(nèi)酯等多種類別。靈芝三萜類化合物的提取程序較為復(fù)雜，且有多種提取方法，其中超聲波處理方法可以破壞靈芝的細(xì)密結(jié)構(gòu)，提高三萜的提取率，并能夠減少三萜類化合物提取時間。研究表明，靈芝三萜類化合物具有保肝作用，不僅對 CC14和 D-氨基半乳糖引起的肝損傷有保護(hù)作用，對免疫性肝損傷的治療效果也極其顯著，且 GT2的有效劑量明顯要低于臨床常見保肝藥馬洛替酯。同時靈芝三萜類化合物對免疫性肝損傷時升高的一氧化氮水平具有降低的表現(xiàn)[14-18]。

從現(xiàn)在醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，靈芝在提高人體免疫力，減緩衰老的作用當(dāng)中，效果顯著。在調(diào)節(jié)人體的神經(jīng)系統(tǒng)和減少人體的心腦血管疾病等方面有著重大的作用。從靈芝中提取出來的有效物質(zhì)可以制成多種藥劑，可以有效的抑制腫瘤、調(diào)節(jié)心腦血管、改善肝功能等。靈芝還可以和多種藥物配合，來治療神經(jīng)衰弱夜不安、白細(xì)胞減少、糖尿病、冠心病、胃潰瘍、腎炎、肝炎和三高等多種病癥，靈芝所具有這些藥理功效的根本是源于靈芝所含的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分。本試驗第一部分，通過對野生靈芝和人工栽培靈芝營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分比較，對比其之間的差異，為靈芝的食用、藥用提供更有力的科學(xué)依據(jù)，發(fā)揮其潛在的更大功能，使不同靈芝得到更廣泛的應(yīng)用；第二部分，為不同靈芝發(fā)酵液篩選合適的中藥來增加靈芝的活性成分，提高靈芝的品質(zhì)，使其產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益，為靈芝的進(jìn)一步開發(fā)提供指導(dǎo)作用。

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第二章 不同品種靈芝營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分含量分析

邢增濤[44]等人對不同品種靈芝中三萜類化合物比較研究表明不同品種的靈芝中三萜類化合物的種類和含量存在不同差異。鄭林用[45]等人也對不同靈芝的多糖、三萜比較分析，表明不同靈芝的多糖和三萜類化合物是不相同的。周選偉[19]等人對靈芝蛋白類活性成分的研究進(jìn)展，表明了蛋白質(zhì)也是靈芝的重要營養(yǎng)成分。同時，還對靈芝所含的其它營養(yǎng)成分進(jìn)行了研究，表明不同靈芝所含的營養(yǎng)成分是不同的。本章，通過對野生靈芝和人工栽培靈芝進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分比較分析，為靈芝的開發(fā)提供更有力的科學(xué)依據(jù)。

2.1 試驗材料與設(shè)備

2.1.1 供試靈芝菌株

2.1.2 主要儀器
TU-1810 紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電熱恒溫水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠；TGL-22 臺式高速冷凍離心機(jī)，北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司；AUX220 電子天平，日本島津公司；DGG-9123A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實驗儀器有限公司；中藥粉碎機(jī)，江陰市富忠機(jī)械有限公司；紅外石英消化爐 SKD-18S2，上海沛歐分析儀器有限公司；SX-5-12 馬弗爐，南京曉曉儀器設(shè)備有限公司；等。
2.1.3 主要試劑

無水葡萄糖（分析純）、苯酚(分析純）、濃硫酸（分析純）、香草醛、無水乙醇、乙醚、熊果酸、高氯酸、冰醋酸、硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉、甲基橙指示劑、硼酸、鹽酸等。

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2.2 試驗方法
水浴鍋 85℃預(yù)熱，在樣品中加入配置好的 85%無水乙醇 100mL，使用索氏提取器在水浴鍋中回流提取 1h，過濾，棄濾液。再加入 85%無水乙醇，水浴鍋中回流提取 1h。提取液過濾，棄濾液。然后再將醇沉后的樣品濾渣中加入 100mL 蒸餾水，100℃沸水回流提取 2h，過濾，棄濾液。再重復(fù)加入 100mL 蒸餾水，100℃回流提取 2h，過濾，合并濾液。將樣品溶液在 250mL 容量瓶中定容，搖勻。
精確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.3mL 0.6mL 0.9mL 1.2mL 1.5mL 1.8mL 置于具塞試管中，加蒸餾水至 2.0mL，搖勻。用蒸餾水 2.0mL 作為空白，然后冰浴中加入5%苯酚溶液1mL、濃硫酸 5mL 充分搖晃均勻，靜置5min。再沸水浴中加熱 15min后拿出，冷卻至室溫。按照紫外分光光度法，于 490nm 波長處測定其吸光度(Abs)。以葡萄糖濃度 mg·mL-1為橫坐標(biāo)，吸光度（Abs）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
精確吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL至具塞試管中，100℃水浴蒸干后加入 5%的香草醛-冰醋酸溶液 0.5mL，搖勻，再加入高氯酸溶液 0.8mL，置于 60℃水浴鍋中 20min，取出后于冰浴中加入冰乙酸5mL，搖勻，室溫下放置 15min。以無熊果酸對照品溶液的試管為空白，同法操作，于 548nm 條件下測定吸光度。以熊果酸（X）的質(zhì)量為水平坐標(biāo)，吸光度（Y）為垂直坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)裝 2/3 的蒸餾水，同時加入甲基橙指示劑和硫酸，保持水為酸性，蒸餾裝置裝好后在電爐上加熱。吸取硼酸試劑 20mL 置于三角瓶中，加入混合指示劑 2-3 滴。然后再吸取樣品消化液 10mL 到反應(yīng)管內(nèi)，同時加入 10mLNaOH溶液，將玻璃塞塞好，并在入口處加水密封，防止漏氣。加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內(nèi)的水進(jìn)行蒸餾，蒸餾 4min 降下錐形瓶，將冷凝管末端離開吸收液面，再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，洗液均流入錐形瓶內(nèi)，，然后停止蒸餾。重復(fù)三次，記錄試驗測定結(jié)果。

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第三章 添加中藥對不同品種靈芝菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響.....26
3.1 試驗材料與設(shè)備..................................................26
3.1.1 材料與儀器.................................................26
第四章 結(jié)論及展望.................................................31
4.1 主要研究結(jié)論.................................................31
4.1.1 不同品種靈芝之間營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分比較分析................31

4.1.2 提高靈芝活性成分途徑初探...................................32

第三章 添加中藥對不同品種靈芝菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響

靈芝作為我國傳統(tǒng)的珍貴醫(yī)藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明其藥理作用功效顯著[46-47]。食藥用真菌的強(qiáng)大酶系可以分解利用蛋白質(zhì)、脂類、纖維素、淀粉等物質(zhì)，在培養(yǎng)基中添加一些中藥成分可增強(qiáng)或抑制藥用真菌的生長及代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。而食藥用真菌中的酶系在液體發(fā)酵作用中可能會轉(zhuǎn)化中藥中的某些成分，包括對中藥成分和靈芝活性成分的轉(zhuǎn)化，以及它們之間相互作用下產(chǎn)生得到的新成分。篩選與食藥用真菌無抑制作用的中藥，以起到食藥用真菌增加活性成分等作用[48]。本章通過在不同靈芝發(fā)酵液中添加垂盆草和板藍(lán)根 2 種中藥，測定對菌絲體生物量和胞外多糖含量的影響，為靈芝的進(jìn)一步開發(fā)提供指導(dǎo)作用。

3.1 試驗材料與設(shè)備
3.1.1 材料與儀器
3.1.1.1 靈芝品種
美芝、川芝 4 號、Gd1、Gd8、靈芝草、內(nèi)蒙古野生靈芝均為本實驗室保存的菌種，來源詳見表 2-1。
3.1.1.2 中藥
在靈芝液體發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加板藍(lán)根、垂盆草 2 種中藥。
3.1.1.3 主要儀器
JB-CJ-1500FX 凈化工作臺 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司
LS-35HD 型立式壓力蒸汽滅菌器 江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司
HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司
TGL-22 臺式高速冷凍離心機(jī) 北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司
3.1.2 培養(yǎng)基
3.1.2.1 斜面培養(yǎng)基

PDA 綜合培養(yǎng)基配方：馬鈴薯 200g（去皮），葡萄糖 20g/L，磷酸二氫鉀2g/L，硫酸鎂 1g/L，VB12 片/L，瓊脂 20g/L。

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第四章 結(jié)論及展望

4.1 主要研究結(jié)論
4.1.1 不同品種靈芝之間營養(yǎng)物質(zhì)與活性成分比較分析
1.通過對 15 種不同來源的野生靈芝和人工栽培靈芝的營養(yǎng)物質(zhì)和活性成分測定分析比較得出：靈芝多糖的含量范圍在 0.53%~3.05%之間，含量最高為易縣野生白靈芝、易縣野生云靈芝、泰山 3 號�？傮w來看，野生靈芝與人工栽培靈芝的多糖含量根據(jù)品種不同所測含量有所差異，并非野生靈芝的多糖含量全部高于人工栽培靈芝。由于靈芝多糖具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，建議在選擇此方面保健或醫(yī)藥功能的靈芝時，可優(yōu)先選擇多糖含量較高的品種。
2.在靈芝三萜含量方面，野生靈芝和人工栽培靈芝的三萜類化合物含量范圍在 0.47%~1.47%之間，野生靈芝與人工栽培靈芝三萜類化合物差異顯著。野生靈芝三萜含量普遍高于人工栽培靈芝，這可能與野生靈芝在大自然中的生長環(huán)境有關(guān)。靈芝中的三萜類化合物是靈芝中一類特殊成分，對人體能起到有效的保肝護(hù)肝作用。因此對肝病患者而言，野生靈芝較人工靈芝具有更好的醫(yī)療保健作用。
3.在蛋白質(zhì)方面，美芝粗蛋白含量達(dá) 32.05%，南韓 3 號與易縣野生赤芝呈現(xiàn)極顯著差異，易縣野生赤芝粗蛋白含量僅為 7.52%。人工栽培的靈芝粗蛋白含量多數(shù)高于野生靈芝，說明人工栽培靈芝更有助于靈芝蛋白的合成。在實際生產(chǎn)中，如傾向于蛋白質(zhì)含量高的靈芝藥材，可優(yōu)先選育美芝、南韓 3 號、Gd8。

4.從靈芝灰分含量來看，野生靈芝顯著高于人工栽培靈芝。易縣野生白靈芝灰分含量達(dá) 14.69%，而泰山 1 號靈芝灰分含量僅有 1.47%。靈芝灰分中含有大量的礦物質(zhì)，具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能，促進(jìn)新陳代謝、清除體內(nèi)毒素和廢物的作用，在選擇礦物質(zhì)含量較高的靈芝時，可優(yōu)先選擇易縣野生白靈芝、易縣野生赤芝、易縣野生云靈芝、美芝。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：370064