發(fā)布時(shí)間：2017-05-16 06:40

前 言

21 世紀(jì)以來(lái)，傳染病仍然是危害人類生命健康安全的最大威脅之一，全球每年死亡人數(shù)中有 1/4 是死于傳染病，新發(fā)、突發(fā)傳染病逐年增多。如在我國(guó)爆發(fā)的急性重癥呼吸綜合征（SevereAcute Respiratory Syndrome，SARS），僅在 2002年 11 月至 2003 年 7 月間就造成了 8096 人感染，744 人死亡，病死率高達(dá) 9.6%[1]，直接導(dǎo)致我國(guó)經(jīng)濟(jì)損失達(dá) 933 億元人民幣[2]。還有 2009 年在墨西哥爆發(fā)的 H1N1流感疫情，短時(shí)間內(nèi)在全世界迅速傳播，據(jù) WHO 提供信息，截至 2009 年 8 月6 日，全球累計(jì)報(bào)告甲型 H1N1 確診病例已超過(guò) 17 萬(wàn)例[3]。距離我們更近的 2014年，西非爆發(fā)了災(zāi)難性的埃博拉疫情，截至 2015 年 7 月 19 日，死亡人數(shù)達(dá) 11284人，感染人數(shù)達(dá) 27741[1]。這些不斷出現(xiàn)的重大傳染病疫情給病原微生物的檢測(cè)和疾病的診斷提出了更高的要求。因此，研究和發(fā)展快速、特異、靈敏、高效并且簡(jiǎn)便的現(xiàn)場(chǎng)診斷技術(shù)，對(duì)傳染病的治療和預(yù)防具有重要意義。
1、傳染病診斷方法
自 PCR 創(chuàng)建以來(lái)，基于 PCR 原理的各種核酸擴(kuò)增技術(shù)相繼出現(xiàn)，并不斷發(fā)展完善，如逆轉(zhuǎn)錄 PCR（RT-PCR）[5]、實(shí)時(shí)定量 PCR（real-time PCR）[6]、多重 PCR（multiplex PCR）[7]、巢式 PCR（nested PCR）[8]等等，為病原微生物檢測(cè)帶來(lái)突破性發(fā)展。然而無(wú)論是常規(guī) PCR，還是 Real-Time PCR 都不可避免的要經(jīng)歷變性、退火、延伸等熱循環(huán)步驟，需要具備精密昂貴的 PCR 擴(kuò)增儀器才能實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增，這些設(shè)備無(wú)疑限制了其在基層單位以及現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)陋條件下的應(yīng)用，加之?dāng)U增時(shí)間長(zhǎng)，成本高，使這些技術(shù)不適合傳染病的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和床旁診斷。因此，恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。恒溫核酸擴(kuò)增是指在溫度不變的情況下實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增。在 20 世紀(jì) 90 年代，繼 PCR 后，各種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)陸續(xù)發(fā)展起來(lái)。主要的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括依賴于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Nucleic AcidSequence-BasedAmplification ，NABSA）滾環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Rolling CircleAmplification，RCA）、解鏈酶依賴的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Helicase-DependentAmplification ，HDA）、環(huán)介導(dǎo)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermalAmplification，LAMP）、鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（Strand Displacement Amplification，SDA）、重組酶介導(dǎo)的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase AmplificationRPA）。與傳統(tǒng)的常規(guī) PCR 技術(shù)相比，等溫核酸擴(kuò)增擺脫了笨重的 PCR 儀器，并且可以在短時(shí)間內(nèi)得到準(zhǔn)確結(jié)果。

NASBA 技術(shù)[9]是在 1991 年由 Compton J.發(fā)明的基于轉(zhuǎn)錄依賴的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。NASBA 反應(yīng)需要兩條引物和三種功能性酶，包括逆轉(zhuǎn)錄酶、RNase H、RNA 聚合酶，可在在恒溫 41~42℃條件下進(jìn)行，1.5~2h 即可將模板擴(kuò)增 109~1010。結(jié)果判讀可以通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、熒光探針檢測(cè)等來(lái)實(shí)現(xiàn)。該種方法特異性和敏感性較好，但是反應(yīng)成分復(fù)雜，所需酶價(jià)格昂貴，RNA 目的片段長(zhǎng)度受限且結(jié)果判讀仍需要繁雜的后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。已有文獻(xiàn)報(bào)道顯示，該技術(shù)已用于 HIV病毒[10]、肝炎病毒[11]和巨細(xì)胞病毒[12]檢測(cè)。鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（SDA）[13]是 Walker.G.T.等人在 1992 年發(fā)明的一種體外核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該反應(yīng)體系主要包括 4 條引物、限制性內(nèi)切酶、 DNA 聚合酶等，其基本原理是利用不具備外切酶活性的 DNA 聚合酶，在限制性內(nèi)切酶的輔助下，對(duì)單鏈 DNA 模板進(jìn)行鏈置換的循環(huán)反應(yīng)過(guò)程，在 37-40℃條件下 2h 內(nèi)可完成模板 107擴(kuò)增[15]。其結(jié)果判讀主要通過(guò)與熒光偏振等技術(shù)結(jié)合，較為復(fù)雜[16, 17]。目前已被應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌和沙眼衣原體[17]等病原檢測(cè)。該技術(shù)的缺點(diǎn)主要是產(chǎn)物擴(kuò)增后續(xù)檢測(cè)復(fù)雜，且擴(kuò)增產(chǎn)物不一[14, 15]。

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第一部分 布魯氏菌 RPA 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

細(xì)菌是引起傳染病最常見(jiàn)的病原微生物，如何快速檢測(cè)這類病原，對(duì)控制疫情治療患者十分重要。RPA 技術(shù)針對(duì)不同的檢測(cè)靶標(biāo)，具有不同的檢測(cè)方法。這里我們以布魯氏菌為細(xì)菌病原的代表，建立布魯氏菌的 RPA 檢測(cè)方法，探索 RPA用于細(xì)菌檢測(cè)中的一些共性特征。
布魯氏菌病是由布魯氏桿菌引起的動(dòng)物原性人畜共患病。布魯氏菌可侵入人和多種動(dòng)物引起變態(tài)反應(yīng)性傳染病, 染菌動(dòng)物首先在同種動(dòng)物間相互傳播，造成帶菌或發(fā)病，隨后波及人類，危害人類健康，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌病已被《中華人民共和國(guó)傳染病防治法》列為乙類傳染病[43,44]，被 WHO 喻為 21 世紀(jì)人類面臨的最為嚴(yán)重的人畜共患病之一。傳統(tǒng)上布魯氏桿菌屬可分為 6 個(gè)種（包括羊，牛，豬，綿羊附翠，沙林鼠，犬種）以及 19 個(gè)生物型[45]。不同種型其致病能力，感染人畜后癥狀、嚴(yán)重程度不同。羊種布魯氏菌致病性最強(qiáng)，危害最為嚴(yán)重，常引起暴發(fā)流行。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，累及多個(gè)器官和系統(tǒng)，導(dǎo)致多種并發(fā)癥[46]，常常難以診斷，加之缺乏有效地治療方法，病人可能因發(fā)現(xiàn)較晚或未能確診，使病情延誤，繼而轉(zhuǎn)為慢性感染，復(fù)發(fā)率高、難以治愈。因此，準(zhǔn)確快速的檢測(cè)方法對(duì)布病患者的診斷和及時(shí)治療意義重大。傳統(tǒng)的布病實(shí)驗(yàn)室診斷主要包括分離培養(yǎng)和血清學(xué)檢測(cè)，分離培養(yǎng)操作復(fù)雜、耗時(shí)久，并且檢出率低，即使是陰性結(jié)果也不能下結(jié)論。血清學(xué)檢測(cè)則由于抗原抗體出現(xiàn)的量和時(shí)間不一，各種血清學(xué)檢測(cè)方法針對(duì)的抗體和適用對(duì)象也不同，常出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性結(jié)果。定量 PCR 等核酸擴(kuò)增技術(shù)在對(duì)布魯氏菌檢測(cè)研究中表現(xiàn)出了良好的特異性和敏感性，但由于需要昂貴精密的 PCR 儀器，核酸擴(kuò)增時(shí)間也較長(zhǎng)，在臨床應(yīng)用中受到了限制[47-49]。

本研究以布魯氏菌為細(xì)菌病原代表，基于 RPA 技術(shù)的原理，設(shè)計(jì)合成引物探針，通過(guò)篩選引物組合、優(yōu)化體系、分析 mi 敏感性和特異性，建立布魯氏菌的 RPA 檢測(cè)方法，并應(yīng)用于布魯氏菌病患者實(shí)際樣本檢測(cè)，對(duì)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而探討 RPA 檢測(cè)細(xì)菌病原中的共性問(wèn)題。

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1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 菌株與載體
羊種布魯氏桿菌強(qiáng)毒株（B. melitensis, 16M）為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院（中國(guó)人民解放軍疾病預(yù)防控制中心）疾病預(yù)防控制所實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌 DH5α由康為世紀(jì)公司提供。其他菌種均由疾病預(yù)防控制所提供。PMD-18T 購(gòu)自 TaKaRa公司。
1.1.2 主要試劑及配方
1.1.2.1 主要試劑
Taq MasterMix 康為世紀(jì)公司
Wizard SV Gel and PCR Clean-upSystemPromega 公司
Plasmid Mini Kit 康為世紀(jì)公司
Taq DNA 聚合酶，dNTP Takara 公司
PCR Clean-up systerm Promega 公司
T4 DNA 連接酶 NEB 公司
氨芐青霉素 HyClone 公司
胰蛋白胨大豆瓊脂 (TSA) 培養(yǎng)基 生物梅里埃公司
胰蛋白胨大豆肉湯 (TSB) 培養(yǎng)基 生物梅里埃公司
TIANamp Bacteria DNAKit 天根生化科技（北京）
PCR 擴(kuò)增所用引物 上海生工生物技術(shù)公司合成
SuperReal PreMix Plus (SYBR Green) 天根生化科技（北京）
RNasin Ribonuclease Inhibitor（RRI） Takara

TwistAmp exo kit TwistDx, Cambridge, UK

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第三部分 埃博拉病毒 RPA 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.......... 42
1 材料與方法........................................42
2 結(jié)果...............................................46
3 討論..............................................52
4 小結(jié).......................................53

參考文獻(xiàn)........................................54

第二部分 腺病毒 RPA 檢測(cè)方法的研究

病毒是傳染病最為重要病原體，也是最容易引起新突發(fā)傳染病的病原微生物種類。根據(jù)核酸檢測(cè)靶標(biāo)種類的不同，病毒分為 DNA 病毒和 RNA 病毒。DNA病毒和 RNA 病毒的檢測(cè)方法是不同的，對(duì)于 DNA 病毒來(lái)說(shuō)，其檢測(cè)方法與細(xì)菌類似，不存在逆轉(zhuǎn)錄的步驟，相反 RNA 病毒則需要首先將其基因組 RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA 才能進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。腺病毒是引起感染的重要病原微生物，，屬于DNA 病毒。由腺病毒感染引起的疫情，已經(jīng)是嚴(yán)重威脅部隊(duì)官兵健康的重要因素，建立該病原檢測(cè)方法，對(duì)于部隊(duì)腺病毒疫情的防控具有重要意義。

腺病毒是一種無(wú)囊膜的雙鏈 DNA 病毒，在感染的細(xì)胞核內(nèi)繁殖，分為 A-G7 個(gè)組 56 個(gè)血清型。常侵犯呼吸道、消化道黏膜和眼結(jié)膜等，導(dǎo)致呼吸道感染、胃腸炎、肺炎以及結(jié)膜炎等疾病，累及多個(gè)器官，小兒和免疫功能低下的人極易感染，且缺乏特效的治療方法。作為一種人畜共患的急性傳染病，在全球世界各地都曾暴發(fā)流行[51,52]。腺病毒主要的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法包括病毒分離、免疫學(xué)檢測(cè)和 PCR/Real-timePCR 等。病毒分離操作繁瑣，耗時(shí)久，敏感性低又易污染。免疫學(xué)檢測(cè)常出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果。PCR 需要精密笨重的儀器設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間也較長(zhǎng)，不能滿足疫情爆發(fā)時(shí)現(xiàn)場(chǎng)快速診斷的需要。對(duì)于腺病毒核酸檢測(cè)來(lái)說(shuō)，一個(gè)重要的特點(diǎn)不同型別的病毒的序列變異較大，因此，建立的方法應(yīng)盡可能覆蓋足夠多的型別。本研究中，我們以腺病毒為研究對(duì)象，建立腺病毒的 RPA 檢測(cè)方法，對(duì)方法的敏感性和特異性進(jìn)行初步的評(píng)價(jià)。

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第三部分 埃博拉病毒 RPA 檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

遺傳物質(zhì)為 RNA 的病毒屬于 RNA 病毒。對(duì)于 RNA 病毒來(lái)說(shuō)，在其復(fù)制過(guò)程中，需要轉(zhuǎn)錄出其互補(bǔ)的 DNA 或者 RNA。對(duì)于 RNA 病毒的檢測(cè)，需要用逆轉(zhuǎn)錄酶將其RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，然后才能進(jìn)行擴(kuò)增，因此，RNA 病毒的檢測(cè)與細(xì)菌和 DNA 病毒的檢測(cè)不同，需要有逆轉(zhuǎn)錄的步驟。另外，很多 RNA 病毒的變異往往較 DNA病毒變異大。為了探討 RNA 病毒的 RPA 檢測(cè)方法，我們選擇埃博拉病毒作為代表，建立該病毒的檢測(cè)方法，并應(yīng)用于實(shí)際樣本的檢測(cè)。
埃博拉病毒 EBOV 屬絲狀病毒科[53]，是單股負(fù)鏈 RNA 病毒[54]，常感染人和靈長(zhǎng)類動(dòng)物，引起埃博拉出血熱�。‥BOV Hemorrhagic Fever），該病感染率致死率極高。2014 年 3 月，幾內(nèi)亞首先出現(xiàn)埃博拉疫情，隨后迅速蔓延至周邊國(guó)家以及整個(gè)非洲，歐洲和美洲也被波及[55-57]。從爆發(fā)開始到 2015 年 4 月，已有28457 例患者感染，11297 例患者死亡，是迄今為止規(guī)模最大、疫情最嚴(yán)重的一次疫情，被 WHO 正式列為國(guó)際關(guān)注的公共衛(wèi)生緊急事件。EBOV 實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)主要包括病毒分離，ELISA 以及 RT-PCR[58-61]。病毒分離操作復(fù)雜繁瑣，周期長(zhǎng)，需要在 BSL-4 實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，因此不能作為常規(guī)檢測(cè)方法�；诳乖贵w結(jié)合原理的ELISA 敏感性較低，常出現(xiàn)假陰性，對(duì)疾病的早期診斷不適用。RT-PCR 由于其高敏感性特異性等優(yōu)點(diǎn)，成為此次 EBOV 疫情的主要診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而 RT-PCR 這種實(shí)驗(yàn)室診斷方法需要精密的儀器設(shè)備，而且病毒核酸提取甚為復(fù)雜，很難應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。因此，建立一種快速準(zhǔn)確的 EBOV 檢測(cè)方法對(duì)于治療患者、控制疫情尤為重要。

本研究中，我們以 2014 年爆發(fā)流行的埃博拉毒株的基因組序列為靶標(biāo)，針對(duì)病毒 N 蛋白基因序列，設(shè)計(jì) RPA 引物探針，建立了檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行了應(yīng)用評(píng)價(jià)。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號(hào)：369964