第一章 文獻(xiàn)綜述

1.1 益生菌和益生性能
1.1.1 乳酸菌簡介
乳酸菌（lactic acid bacteria, LAB）廣泛存在于自然界中，它是一類可發(fā)酵糖類并且代謝產(chǎn)生乳酸、無芽孢、革蘭氏陽性細(xì)菌的統(tǒng)稱。早在遠(yuǎn)古時期，人類就在食品加工或者釀造過程中不自覺的應(yīng)用了乳酸菌。隨著微生物學(xué)研究的不斷深入，人們逐漸認(rèn)識和掌握了乳酸菌的特性，并越來越廣泛的將其應(yīng)用于人類的生產(chǎn)和生活中。除少數(shù)致病菌外，絕大多數(shù)乳酸菌被公認(rèn)為益生菌（Probiotics）。益生菌源于希臘語“對生命有益的細(xì)菌”，是一類對宿主有益、定植于宿主腸道和生殖系統(tǒng)內(nèi)，可通過產(chǎn)生確切健康功效和發(fā)揮有益作用來改善宿主體內(nèi)微生態(tài)平衡的有益微生物的總稱。自 90 年代初以來，益生菌受到非常廣泛的關(guān)注。目前，益生菌被應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。形形色色的“益生菌”類保健品已經(jīng)風(fēng)靡了全世界。
1.1.2 益生菌的研究進(jìn)展

隨著益生菌研究的不斷深入，關(guān)于“益生菌”的定義出現(xiàn)了很多的爭議。最近的研究發(fā)現(xiàn)，益生菌的健康功效具有菌株依賴性，并非屬于乳桿菌屬（Lactobacillus spp.）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium spp.）的菌株都具有益生作用（Zanoni et al. 2008）。此外，死菌、細(xì)菌代謝物或者細(xì)菌性的衍生物都能提供保健作用（Prisciandaro et al. 2009），這些物質(zhì)也被研究者定義為“益生菌”。Argyri 等人（2013）認(rèn)為，益生菌在胃腸道（Gastrointestinal tract, GIT）的定植能力不會影響他們對宿主健康功效的發(fā)揮。另外，不同來源的益生菌的保健功效是否有所差異呢？這一問題還有待于探討（Foligné et al.2010）。益生菌普遍存在于人體和動物的腸道中，也存在于發(fā)酵的食品中。目前，屬于乳桿菌屬和雙歧桿菌屬且具有益生性能的 LAB 菌株大多都是從人體腸道中分離出來的（Kullisaar et al. 2002; Lin and Yen 1999; Mikelsaar and Zilmer 2009; Spyropoulos et al.2011; Zanoni et al. 2008）。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)來源于非土著微生物或者極端微生物的乳酸菌也能向宿主提供特殊的健康功效，這可能是因?yàn)檫@些微生物和其它乳酸菌都有著類似的結(jié)構(gòu)特性或者功能特性（Foligné et al. 2010）。

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1.2 葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵
1.2.1 蘋果酸-乳酸發(fā)酵
蘋-乳發(fā)酵影響了葡萄酒的品質(zhì)，葡萄酒經(jīng)過蘋-乳發(fā)酵后，葡萄酒中的化學(xué)物質(zhì)、香氣物質(zhì)、顏色和感官性能均發(fā)生改變。酒酒球菌是啟動蘋-乳發(fā)酵發(fā)酵的主要微生物，它主要起到三個方面的作用：第一，降解蘋果酸。L-蘋果酸在酒酒球菌蘋果酸乳酸酶的作用下轉(zhuǎn)化為L-乳酸和CO2，并最終影響了葡萄酒的pH。第二，增加葡萄酒的微生物穩(wěn)定性。第三，改變葡萄酒的感官品質(zhì)，包括葡萄的風(fēng)味、顏色和口感等（Versari et al. 1999; Costello et al. 2012）。
1.2.2 影響蘋果酸-乳酸發(fā)酵的因素
蘋-乳發(fā)酵過程受到乳酸菌菌株、葡萄品種、釀造工藝等的影響（Costello et al. 2012）。最近的研究發(fā)現(xiàn)，蘋-乳發(fā)酵前葡萄酒的 pH 和乙醇濃度也是非常重要的影響因素，這是因?yàn)槠咸丫迫樗峋奶妓衔锎x受到 pH 的影響（Liu et al. 1995），而不同的酒酒球菌菌株對乙醇的耐受性不同，從而影響了發(fā)酵后的葡萄酒中化學(xué)物質(zhì)、芳香揮發(fā)物、風(fēng)味、口感和顏色（Costello et al. 2012; Knoll et al. 2011）。
1.2.3 蘋果酸-乳酸發(fā)酵對葡萄酒化學(xué)物質(zhì)的影響

蘋-乳發(fā)酵改變了葡萄酒的揮發(fā)性成分，包括酯類、高級醇、脂肪酸、萜烯類和內(nèi)酯類物質(zhì)等（Avedovech et al. 1992; Boido et al. 2009; D’Incecco et al. 2004; du Plessis et al.2002; Herjavec et al. 2001; Izquierdo Ca as et al. 2008; Knoll et al. 2011; Laurent et al. 1994;Lee et al. 2010; López et al. 2011; Malherbe et al. 2012; Maicas et al. 1999; Pozo-Bayón et al.2005; Sumby et al. 2010; Ugliano and Moio 2005）。葡萄酒的中的乳酸菌能夠影響白葡萄酒（Avedovech et al. 1992; Herjavec et al. 2001; Knoll et al. 2011; Laurent et al. 1994）和紅葡萄酒（Boido et al. 2009; Izquierdo Ca as et al. 2008; Lee et al. 2010; Maicas et al. 1999;Malherbe et al. 2012; Pozo-Bayón et al. 2005; Ugliano and Moio 2005）中揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量。最近的研究發(fā)現(xiàn)，不同的菌株對葡萄酒中揮發(fā)性物質(zhì)如酯類物質(zhì)的影響不同（Sumby et al. 2010）。Delaquis 等人（2000）認(rèn)為蘋-乳發(fā)酵后，葡萄酒的芳香和風(fēng)味的改變是由于乳酸菌和酵母代謝產(chǎn)物之間復(fù)雜的交互作用引起的。

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第二章 高抗氧化活性酒酒球菌的篩選及其特性研究

2.1 引言
食品微生物的益生特性受到研究者越來越廣泛的關(guān)注。最近的研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒中的乳酸菌如酒酒球菌也具有益生特性，例如 O. oeni IOEB 9115 菌株就具有免疫調(diào)節(jié)性能和抗炎性能，，它能夠緩解體內(nèi)結(jié)腸炎癥狀并降低結(jié)腸炎損傷（Foligné et al. 2010）。O. oeniX2L 和 m1 菌株均具有蛋白質(zhì)水解能力，它們可以將葡萄酒中的蛋白轉(zhuǎn)化成具有抗氧化和抗高血壓能力的多肽（Apud et al. 2013a; Aredes Fernández et al. 2011; Manca de Nadraet al. 2007）。若使用 O. oeni m1 和 X2L 菌株進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵，能夠增加所釀造葡萄酒的抗氧化和抗高血壓的性能（Apud et al. 2013a, 2013b; Aredes Fernández et al. 2011）。許多的乳酸菌像乳桿菌和雙歧桿菌被證明具有體外和體內(nèi)抗氧化能力（Amaretti et al. 2013;Lin and Yen 1999; Mikelsaar and Zilmer 2009; Songisepp et al. 2005; Spyropoulos et al.2011; Zanoni et al. 2008）。然而，目前對于酒酒球菌抗氧化活性的研究報(bào)道還很有限。因此，本研究利用不同的抗氧化評價方法對 20 株酒酒球菌和 1 株對照菌株的體外抗氧化性能進(jìn)行測定和分析。

隨著人們對人體健康、腸道微生物和益生菌之間聯(lián)系的不斷探索，益生菌對人體胃腸道有益的保健功能引起了研究人員廣泛的關(guān)注。雖然研究者們對益生菌的定義有很多的爭議，但是大多數(shù)研究者認(rèn)為益生菌進(jìn)入到人體胃腸道后才能發(fā)揮其潛在的益生功效，因此它們必須能夠耐胃腸道嚴(yán)酷的生存環(huán)境。影響益生菌在胃腸道存活的因素有很多，如胃液的 pH 值、膽鹽的濃度、停留的時間等（Bezkorovainy 2001）。人體消化道中所分泌的胃液的低酸性環(huán)境阻止了大多數(shù)微生物進(jìn)入腸道。根據(jù)人們飲食結(jié)構(gòu)的不同，胃液pH 值不斷發(fā)生變化，通常其 pH 值在 3 左右；當(dāng)食用酸性食品時，胃液 pH 值可達(dá)到 1.5左右；當(dāng)食用堿性食品時，胃液 pH 值約在 4～5 之間。因此，具有較強(qiáng)的耐酸和耐膽鹽特性成為篩選益生菌的先決條件。另外，當(dāng)益生菌進(jìn)入人體腸道后，其對腸道上皮細(xì)胞的粘附作用影響了它們在人體腸道內(nèi)的定植及繁殖，這對其保健作用的發(fā)揮同樣有著重要影響。因此，益生菌在腸道中的粘附能力也是篩選益生菌的重要指標(biāo)之一。研究發(fā)現(xiàn)，益生菌在粘附細(xì)胞單分子層的同時會表現(xiàn)出疏水特性，這種細(xì)胞表面的疏水性與其粘附特性之間存在密切的聯(lián)系。最近幾年，細(xì)菌表面疏水性常常被用來評估細(xì)菌的粘附能力（Maldonado et al. 2012; Shakirova et al. 2013; Zago et al. 2011）。為了了解酒酒球菌的生理特性，本章對酒酒球菌在模擬胃腸液中的耐受性以及其體外疏水特性進(jìn)行了研究。

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2.2 材料與儀器
2.2.1 菌株
酒酒球菌菌株：HB-1a、SD-1c、SD-2gh、SD-1a、SD-2kj、SX-1a、SD-1g、HB-2b、SD-2d、SX-1b、SD-2gf、HB-1b、HB-1c、SD-2ji、SD-1f、SD-2b、SD-1e、SD-2ee 和SD-2a。這些菌株來自前期篩選并已進(jìn)行了鑒定（Li et al. 2006; 王華等 2010）。O. oeni31-DH（O. oeni CICC 6066）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）CICC 6032由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection, CICC）提供。
2.2.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件
ATB 液體培養(yǎng)基（趙文英，2008）：10 g/L 葡萄糖、10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母浸粉、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.05 g/L MnSO4·4H2O、0.5 g/L L-半胱氨酸鹽酸鹽、25%番茄汁（v/v），蒸餾水配制。調(diào)節(jié)溶液 pH 值至 4.8，121℃高壓蒸汽滅菌 20 min。將冷凍保藏的 O. oeni SD-2a 菌液轉(zhuǎn)接至 ATB 液體培養(yǎng)基中，25℃靜置培養(yǎng)。以 2%的接種量轉(zhuǎn)接到新鮮液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化培養(yǎng)。L. bulgaricus 在添加 0.05% L-半胱氨酸鹽酸鹽的 MRS 液體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，37℃靜置培養(yǎng)。
2.2.3 試劑

鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）、丁基化羥基甲苯（BHT）、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、L-半胱氨酸鹽酸鹽、亞油酸、氯仿、鄰菲羅啉等試劑均為國產(chǎn)分析純。羥自由基測試試劑盒、抑制與產(chǎn)生超氧陰離子自由基測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測定試劑盒、谷胱甘肽還原酶（GR）測定試劑盒、總谷胱甘肽（T-GSH）/氧化型谷胱甘肽（GSSG）測定試劑盒都購買自南京建成生物工程研究所。

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第三章 抗氧化性能不同的酒酒球菌對品麗珠葡萄酒品質(zhì)的影響...........35
3.1 引言...................................................... 35
3.2 材料與儀器................................................. 35
第四章 還原型谷胱甘肽對品麗珠葡萄酒品質(zhì)的影響.................59
4.1 引言........................................................ 59
4.2 材料與儀器....................................................... 59
第五章 經(jīng)預(yù)適應(yīng)性培養(yǎng)的酒酒球菌 SD-2a 對品麗珠葡萄酒品質(zhì)的影響.....85
5.1 引言............................................................ 85

5.2 材料與儀器....................................................... 85

第六章 蘋果酸-乳酸發(fā)酵過程中酒酒球菌不同基因的表達(dá)情況

6.1 引言

第四章的研究發(fā)現(xiàn)葡萄酒進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵前添加一定濃度的 GSH 有利于葡萄酒的品質(zhì)；第五章的研究發(fā)現(xiàn) GSH 促進(jìn)了酒酒球菌的生長，經(jīng)預(yù)適應(yīng)性培養(yǎng)（含 GSH 的培養(yǎng)基）的 O. oeni SD-2a 更有利于葡萄酒的品質(zhì)。為了進(jìn)一步弄清楚上述環(huán)境中與 O. oeniSD-2a 代謝相關(guān)基因和脅迫適應(yīng)性相關(guān)基因表達(dá)的情況。因此，本研究以 O. oeni SD-2a為發(fā)酵劑，在添加了 GSH 的模擬葡萄酒中進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵；同時將經(jīng)不同適應(yīng)性培養(yǎng)的O. oeni SD-2a 接種于模擬葡萄酒中進(jìn)行蘋-乳發(fā)酵。然后對不同模擬葡萄酒環(huán)境中 O. oeniSD-2a 的生長情況和降解蘋果酸的情況進(jìn)行了分析，并研究了不同發(fā)酵時期 O. oeniSD-2a 中 2 種與代謝相關(guān)基因（mleA、citE）以及 8 種與酒酒球菌脅迫適應(yīng)性相關(guān)基因（hsp18、clpP、clpX、ctsR、gsh、trxA、cfa、rmlB）的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性。

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6.2 材料與儀器
6.2.1 試驗(yàn)菌株

菌株：O. oeni SD-2a。按照表 6-1 進(jìn)行菌株的培養(yǎng)和在模擬葡萄酒培養(yǎng)基中接種。

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第七章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)與展望

7.1 結(jié)論
本論文評估了酒酒球菌作為益生菌的潛力，篩選出了具有高抗氧化活性的酒酒球菌；研究了具有較高抗氧化性能的酒酒球菌單獨(dú)作用或和 GSH 共同作用時對蘋-乳發(fā)酵后的葡萄酒品質(zhì)的影響；篩選出了酒酒球菌在接種前進(jìn)行預(yù)適應(yīng)性培養(yǎng)的最佳方式，并評估了該培養(yǎng)方式獲得的菌株對蘋-乳發(fā)酵后的葡萄酒品質(zhì)的影響。主要結(jié)論如下：
（1）本研究初步證明了酒酒球菌在體外抗氧化方面的有效性，將來仍需要通過體外和體內(nèi)試驗(yàn)來研究酒酒球菌包括其抗氧化性能在內(nèi)的益生性能及其可能的應(yīng)用范疇。與酒酒球菌抗氧化性能有關(guān)的多重機(jī)制、相關(guān)的基因及防御系統(tǒng)仍需要進(jìn)一步的研究。
（2）GSH 具有促進(jìn)酒酒球菌生長的作用。然而目前就其作用機(jī)制方面仍需深入研究。如探討谷胱甘肽在酒酒球菌抵抗酸或/和乙醇脅迫中酒酒球菌基因轉(zhuǎn)錄組的變化。

（3）將來需要對葡萄酒蘋-乳發(fā)酵過程中 GSH 的添加時間和添加劑量以及 GSH 對蘋-乳發(fā)酵階段、陳釀階段葡萄酒品質(zhì)的影響等方面進(jìn)行研究。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：239568