第一章 緒論

1.1 羽毛概述
1.1.1 羽毛資源現(xiàn)狀
隨著全球工業(yè)化的發(fā)展和人口的增長，人們對家禽肉類的需求量逐年增多。據(jù)美國農(nóng)業(yè)部統(tǒng)計(jì)，僅美國商業(yè)家禽屠宰總計(jì)就將近 90 億只肉雞，2.4 億只火雞，3 千萬只鴨等[1]。家禽的大規(guī)模養(yǎng)殖也相應(yīng)會產(chǎn)生大量廢棄物，美國每年因此產(chǎn)生的羽毛約在180 萬噸，我國也擁有豐富的羽毛等大宗低值蛋白資源，僅每年產(chǎn)生的羽毛下腳料就將近 70 萬噸[2]，但用于服裝行業(yè)的羽絨制品才 3 萬噸左右，飼料行業(yè)則不足 10 萬噸，大多數(shù)被焚燒、掩埋處理[3]。羽毛中的角蛋白含量高達(dá) 90%左右，羽毛角蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，質(zhì)地堅(jiān)硬、不溶于水，必須通過物理或化學(xué)手段處理提高其生物利用率。若沒有合適的加工處理方式，羽毛幾乎沒有經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且造成環(huán)境污染。
1.1.2 羽毛角蛋白的結(jié)構(gòu)

球狀蛋白質(zhì)一般都是水溶性的，且大多具有一定的生理與營養(yǎng)功能。膜蛋白通常與細(xì)胞的各種膜系統(tǒng)結(jié)合而存在，不溶于水但能溶于去污劑溶液。纖維狀蛋白質(zhì)通常沒有明顯的生理活性，主要對生物體起保護(hù)、支持和能量儲存等作用。它由沿軸向平行排列、相對伸展的多肽鏈組成，呈長棒狀纖維或薄片層形式。纖維狀蛋白質(zhì)通常含有大量重復(fù)的二級結(jié)構(gòu)單元，易形成分子排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)致密的結(jié)晶區(qū)，這些特點(diǎn)決定了它是一種抗性很強(qiáng)的硬性蛋白，幾乎不溶于水，也不被一般蛋白酶水解[4]。角蛋白是一類典型的纖維狀蛋白質(zhì)，廣泛分布于生物體的表皮組織中，是毛發(fā)、羽毛、羊毛、蹄、角、指甲等的主要組分。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)相對含量的不同，角蛋白可分為 α 角蛋白和 β 角蛋白。其中，α 角蛋白由“卷曲螺旋”型 α 螺旋構(gòu)成，以羊毛角蛋白和，毛發(fā)角蛋白為代表；β 角蛋白富含甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸等小側(cè)鏈氨基酸殘基，由伸展的反向平行 β 折疊片堆疊而成，以絲素蛋白和羽毛角蛋白為代表[4]。根據(jù)二硫鍵含量的不同，角蛋白又可分為硬角蛋白和軟角蛋白。前者因含有大量的二硫鍵，結(jié)構(gòu)致密，如羊毛、羽毛、指甲等表皮附屬物；后者含有較少的二硫鍵，結(jié)構(gòu)相對松散，多見于皮膚、角質(zhì)層等[5]。

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1.2 角蛋白的解聚方法
由前文分析可知，角蛋白含有大量的二硫鍵、疏水相互作用、氫鍵、離子鍵等化學(xué)鍵，具有折疊緊密的二級結(jié)構(gòu)單元，可形成分子排列規(guī)則、結(jié)構(gòu)致密的結(jié)晶區(qū)，這些特點(diǎn)決定了它是一種抗性很強(qiáng)的硬性蛋白，幾乎不溶于水、酸、弱堿等常規(guī)試劑，也不被一般蛋白酶水解[4]。因此為了更好地利用角蛋白這一豐富的天然蛋白資源，科技工作者不斷努力探索角蛋白的有效解聚方法。
1.2.1 物理法
物理法通常采用機(jī)械粉碎、高溫、擠壓、擠出、微波、超聲波法等方法使蛋白質(zhì)內(nèi)部的二硫鍵斷裂，破壞其空間結(jié)構(gòu)從而使得角蛋白發(fā)生解聚，該放法具有操作簡單、污染小等優(yōu)點(diǎn)，但能耗較高，且產(chǎn)物多為多肽、氨基酸混合物[45]。目前我國仍主要采用傳統(tǒng)的高溫水解法進(jìn)行羽毛角蛋白的解聚處理，使其變?yōu)榈鞍踪|(zhì)凝膠，再通過烘干、粉碎處理成為羽毛粉。此方法生產(chǎn)成本相對較低，但反應(yīng)時間過久造成熱敏性氨基酸的損失，而且往往因設(shè)備落后，只能使羽毛粉消化率得到有限的改善，并且營養(yǎng)價(jià)值差異較大。Hou 等人采用高溫高壓水解-粉碎技術(shù)制備低溶性羊毛粉，發(fā)現(xiàn)高溫高壓水解可顯著降低羊毛纖維中 α 螺旋結(jié)構(gòu)以及二硫鍵的含量[46]。隨著膨化技術(shù)的興起，朱選等初步研究了羽毛擠壓工藝，發(fā)現(xiàn)擠壓作用可使得角蛋白在物理形態(tài)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)上均發(fā)生根本性變化，從而引起角蛋白的解聚[47]。國外 Barone 等人發(fā)現(xiàn)擠壓過程中添加亞硫酸鈉等還原劑可弱化羽毛角蛋白中二硫鍵，可進(jìn)一步提高其擠壓膨化過程中的解聚效果[48]。近期研究人員發(fā)現(xiàn)，羽毛擠壓處理大多需要結(jié)合酶解[42]、堿液[49]等復(fù)合處理才能達(dá)到應(yīng)有效果。
1.2.2 化學(xué)法

化學(xué)法通常采用酸、堿或氧化還原劑處理，通過打斷二硫鍵或者肽鍵的方式，將角蛋白解聚為可溶性蛋白質(zhì)、多肽或氨基酸。如李聞欣采用超聲波輔助酸法制備羊毛角蛋白溶液，有效降低了酸用量，提高了羊毛溶解率[50]。堿處理一般是采用 NaOH 溶液經(jīng)低溫長時[51]或高溫短時[52]處理來溶解角蛋白。Coward-Kelly 等人[17]發(fā)現(xiàn) Ca(OH)2溶液則需要更高的處理溫度才起作用，150 °C 處理 3 h 可溶解 95%的羽毛角蛋白。酸堿法最大缺點(diǎn)是產(chǎn)生大量堿性廢液以及酸蒸汽，污染環(huán)境[53]。

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第二章 羽毛蒸汽閃爆工藝研究

2.1 引言
近年來，國內(nèi)外對羽毛粉的研究一直集中于新型加工方法的探索、加工條件對營養(yǎng)價(jià)值的影響、營養(yǎng)價(jià)值體外評定指標(biāo)以及羽毛粉替代魚粉、豆粕等高值飼料的研究等方面[38, 115, 116]。我國在上世紀(jì)八十年代開始利用羽毛原料，為規(guī)范飼料原料生產(chǎn)、經(jīng)營和使用，，提高飼料產(chǎn)品質(zhì)量，保障養(yǎng)殖產(chǎn)品質(zhì)量安全，農(nóng)業(yè)部最新發(fā)布的《飼料原料目錄》中將羽毛粉界定為家禽羽毛經(jīng)水解或膨化后，干燥、粉碎獲得的產(chǎn)品，其胃蛋白酶消化率不低于 75%。目前我國仍主要采用傳統(tǒng)的加熱水解法進(jìn)行羽毛角蛋白的解聚處理，使其變?yōu)榈鞍踪|(zhì)凝膠，通過烘干粉碎處理成為角蛋白飼料。雖然此方法生產(chǎn)成本較低，但因處于高溫時間太久，熱敏性氨基酸大量損失，而且僅能有限提升羽毛粉生物效價(jià)，并且營養(yǎng)價(jià)值波動較大。

在新型加工方法的探索方面，國內(nèi)外學(xué)者開發(fā)了許多處理方式來提升羽毛粉生物利用率，一般可分為兩大類：熱液處理和微生物酶解[117]。熱液處理通常采用高溫[38]或者高壓[118]條件，并添加稀酸[119]或堿液，如氫氧化鈉[37]，氫氧化鈣[17]，氨水[73]等；微生物酶解法通常篩選能夠降解羽毛的微生物來實(shí)現(xiàn)，如 Bacillus[84, 85]，Kocuria rosea[86]等。然而，熱液處理通常會帶來環(huán)境污染問題；酶解法中酶的成本相對較高，生產(chǎn)周期也很長，這些都限制了該方法的工業(yè)化應(yīng)用。因此，尋找環(huán)境友好、經(jīng)濟(jì)可行的羽毛粉生產(chǎn)工藝具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本章主要探討了蒸汽閃爆處理羽毛的可行性，考察了蒸汽閃爆解對羽毛胃蛋白酶消化率以及蛋白質(zhì)溶解度的影響，并進(jìn)一步評價(jià)了汽爆羽毛粉在雞、豬、貓和狗等單胃動物中的營養(yǎng)價(jià)值。

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2.2 材料與設(shè)備
2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑
鴨毛由杭州啟明星生物營養(yǎng)有限公司提供，其蛋白質(zhì)含量為 90.2%，粗脂肪含量為 1.6%，水分含量為 6.0%；胃蛋白酶（pepsin, P7000），胰蛋白酶 (trypsin)，均購于Sigma-Aldrich 公司；尿素、氫氧化鈉、濃鹽酸（分析純）、硼酸、硫酸鉀、硫酸銅、亞硫酸鈉等，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。
2.2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

蒸汽閃爆機(jī)，QBS-200B 型，鶴壁市正道生物能源有限公司；自動消化裝置，上海晟聲自動化分析儀器有限公司；電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FE20 臺式 pH 計(jì)，瑞士 Mettler-Toledo 公司；研磨粉碎機(jī)，IKAA11 基本型，德國 IKA 集團(tuán)；臺式高速離心機(jī)，CT14D，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；UV1100 紫外可見分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；氨基酸分析儀，L-8900，日本日立公司；Agilent 1100 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

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第三章 羽毛蒸汽閃爆解聚效果及其構(gòu)效關(guān)系研究...............25
3.1 引言 ................................................25
3.2 材料與設(shè)備............................................25
第四章 羽毛角蛋白蒸汽閃爆解離與降解機(jī)制..................38
4.1 引言 ................................................38
4.2 材料與設(shè)備............................................38
第五章 羽毛角蛋白的提取工藝研究..........................52
5.1 引言 ...............................................52

5.2 材料與設(shè)備..........................................52

第五章 羽毛角蛋白的提取工藝研究

5.1 引言
隨著資源危機(jī)與環(huán)境危機(jī)的日益凸顯，廢棄物的資源化、綠色化研究迫在眉睫。相比于傳統(tǒng)石油基塑料材料，羽毛、羊毛、膠原蛋白等纖維狀蛋白質(zhì)具有低值、易獲取、可再生、可降解、結(jié)構(gòu)可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)，這些特點(diǎn)使其能夠成為類似于聚酰胺的優(yōu)良天然生物高分子材料[211]。這些天然蛋白質(zhì)的資源化利用也因此一直是當(dāng)前的熱點(diǎn)問題。近年來，國內(nèi)外研究人員正積極開展羽毛材料的加工利用研究，如食品包裝[2]、可食性膜[29]、生物吸附劑[36]以及其他復(fù)合材料[35]。
與膠原蛋白、肌原纖維蛋白等其他纖維狀蛋白質(zhì)不同，羽毛角蛋白含有大量的分子內(nèi)/間二硫鍵交聯(lián)，這使其很難通過常規(guī)試劑溶解或加工處理。研究表明盡管很多方法都能夠打開二硫鍵，如還原法[43, 44]、氧化法[212, 213]或硫解[58]等，但只有少量的試劑（如硫醇、亞硫酸鹽等）能夠在水解的同時維持蛋白分子結(jié)構(gòu)的完整性。此外，上述方法存在的主要問題是在羽毛、羊毛等纖維狀蛋白質(zhì)的水解/溶解過程中加入了大量的酸、堿、變性劑（尿素、鹽酸胍等）、氧化還原劑、表面活性劑或鹵化劑等化學(xué)試劑，使得角蛋白的提純需經(jīng)過透析和冷凍干燥處理，周期長、效率低、成本高、難以工業(yè)化生產(chǎn)。近年來，相關(guān)報(bào)道采用過熱水法[78, 80]水解羽毛、羊毛角蛋白，但這會使其結(jié)構(gòu)嚴(yán)重降解成氨基酸或多肽，限制其后續(xù)加工利用。

堿提酸沉法被廣泛用來提取植物中蛋白質(zhì)[179, 214]，因?yàn)楦邼舛鹊膲A液能夠斷開或裂解蛋白分子間羰基和硫酸基團(tuán)間的氫鍵[215]，從而引起蛋白質(zhì)的溶解。鑒于該方法在食品工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，有必要研究其在羽毛角蛋白提取方面的潛力。盡管前人研究發(fā)現(xiàn)羽毛在 1 N NaOH，室溫[29]或 0.25 N NaOH，120 °C[52]條件下較易溶解，但如此極端堿處理?xiàng)l件會導(dǎo)致蛋白質(zhì)肽鏈的大量降解，不利于維持其蛋白結(jié)構(gòu)的完整性，也不利于角蛋白材料的后續(xù)利用。本章主要研究蒸汽閃爆結(jié)合堿法提取羽毛角蛋白的可行性，考察了汽爆參數(shù)以及不同的堿法提取參數(shù)（如料水比、堿液濃度、提取時間、提取溫度等）對羽毛溶解率和角蛋白得率的影響，評估了提取的羽毛角蛋白的結(jié)構(gòu)和化學(xué)變化，并進(jìn)一步研究了羽毛角蛋白的功能性質(zhì)。

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主要結(jié)論與展望

主要結(jié)論
1. 蒸汽閃爆對羽毛的物理性狀、胃蛋白酶消化率、溶解性能以及胱氨酸等均有顯著影響，而對粗蛋白含量，其他氨基酸含量影響不顯著。其中，蛋白質(zhì)溶解度和胃蛋白酶消化率隨著汽爆強(qiáng)度的增大而增大，胱氨酸含量隨汽爆強(qiáng)度的增大而減小。為防止羽毛粉加工不足與加工過度，確定了合適的胃蛋白酶消化率范圍為 75%~85%，溶解度范圍為 25%~35%，此時的汽爆壓力為 1.4~1.6 MPa，保壓時間 1 min。通過比較羽毛粉胃蛋白酶消化率、蛋白質(zhì)溶解度與有效胱氨酸含量的相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)可選擇操作方便的蛋白質(zhì)溶解度指標(biāo)用來指示汽爆羽毛粉是否已加工過度。
2. 掃描電子顯微鏡結(jié)果表明蒸汽閃爆使得羽毛纖維外觀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯破損，規(guī)則、緊密的結(jié)構(gòu)逐漸消失；X 射線衍射分析表明羽毛纖維中晶面間距增大，結(jié)晶度明顯下降；傅立葉變換紅外光譜表明羽毛纖維大分子肽段構(gòu)象由分子間 β 折疊向分子內(nèi) β折疊轉(zhuǎn)變，肽鏈間的氫鍵締合作用減弱；熱物性分析顯示，羽毛角蛋白晶體微觀結(jié)構(gòu)遭到破壞，熔融溫度降低，使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部分親水基團(tuán)裸露與水分子形成氫鍵。

未處理羽毛角蛋白的分子間作用力主要通過氫鍵與二硫鍵的交互作用類型存在。隨著汽爆處理強(qiáng)度的增大，氫鍵與二硫鍵的交互作用效應(yīng)逐漸變?nèi)�，非共價(jià)鍵作用逐漸增強(qiáng)。羽毛角蛋白的添加 β-巰基乙醇前后的尿素溶液以及稀堿液中的溶出行為均表明羽毛角蛋白汽爆處理后發(fā)生異質(zhì)化，并形成了新的共價(jià)交聯(lián)。隨著蒸汽閃爆處理強(qiáng)度的增大，二硫鍵含量顯著降低，游離巰基呈先減小后增大的趨勢，二硫鍵的降解與游離巰基的增加不成比例也表明羽毛角蛋白蒸汽閃爆過程中形成了新的化學(xué)交聯(lián)。

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參考文獻(xiàn)（略）

本文編號：208569