第一章緒論

目前,大部分抗生素被用于獸醫(yī)領(lǐng)域來增加養(yǎng)殖場的產(chǎn)量。據(jù)統(tǒng)計,在美國食品動物的抗生素供給量大約是人用抗生素的4倍。多種抗生素都是動物食品及人醫(yī)臨床通用的,因此會增加人畜共患的耐藥菌感染疾病出現(xiàn)的頻率和傳播風險。通過藥物在動物體內(nèi)藥動學和特殊的轉(zhuǎn)化進程,超過50%上的藥物通常會以母體或者仍具有活性的代謝物形式排出體外有研究報道,口服嚼旋后10天采集糞便仍有超過96%的藥物以藥物原型或者代謝物的形式排出。在動物糞肥中,抗生素的濃度通常比較穩(wěn)定或者因為代謝物被重新轉(zhuǎn)化成藥物原型而增加,這些含有島濃度的抗生素及仍具有生物活性的代謝物會通過施肥灌概的形式直接進入農(nóng)田,如圖1-6所示。這些殘留的藥物根據(jù)其自身的特性在環(huán)境中降解的時間也不同,有的可以在土壤環(huán)境存在幾個月甚至幾十年。這些物質(zhì)不僅會對細菌菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響,還能促進耐藥基因及可轉(zhuǎn)移元件在環(huán)境菌株中的傳播。

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第二章豬場環(huán)境土壤中氟苯尼考耐藥基因污染水平的研究

2.1前言

隨著抗生素的廣泛使用,越來越多攜帶抗生素耐藥基因的茵株被相繼報道,這些耐藥菌的出現(xiàn)也大大增加了抗生素對細菌感染性疾病治療的難度。土壤作為一個公認的耐藥基因儲存庫,多種耐藥基因及耐藥菌在土壤中被檢出。許多研究也表明抗生素與耐藥菌、耐藥基因會以糞肥的形式由動物體內(nèi)進入土壤環(huán)境中,并且會隨著灌概時間的增長耐藥基因的豐度會隨之增加。如Fang等研究者對使用糞肥所灌概的農(nóng)田土壤中耐藥基因及抗生素污染水平進行研究,這些糞肥用來源于長期使用抗生素的窩類動物,發(fā)現(xiàn)灌概年限越長土壤中抗生素及耐藥基因。這些土壤中的耐藥基因及耐藥菌很可能通過人類直接接觸或以食物鏈的形式進入到人體,進而通過人類活動傳播到更為廣泛的環(huán)境中去,造成不可按制的局面。氟苯尼為第三類胺醇類獸醫(yī)專用抗菌藥,自1990年批準上市來廣泛用于食源性動物的呼吸道疾病及腸道疾病的防治,然而大量的使用導致許多細菌獲得了FFC藥性。從2016年至今已發(fā)現(xiàn)6種特異性耐藥基因,包括外排累基因如,不僅可異丙胺醇類抗生素產(chǎn)生耐藥,還同時介導林可胺類、短側(cè)耳素類、鏈陽菌素A類等其他4類結(jié)構(gòu)各異的抗生素耐藥。

2.2材料與方法

使用表2-2中的目的基因引物進行PCR擴增,1個濃度添加3個平化擴增體系如表2-5所示,體系為20,上下顛倒混勻后使用手掌離心機短暫離心30s。熒光定量PCR反應程序見表2-6。每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的瞬值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))為橫坐標X,起始模板拷貝數(shù)的卻數(shù)為縱坐標Y,這兩者之間存在線性關(guān)系,利用PCR反應得到的Ct值和已知的起始模板拷貝數(shù)的對數(shù)制作標準曲線。而溶解曲線是指定量PCR反應結(jié)束之后讓樣品繼續(xù)升溫直到PCR產(chǎn)物的雙鏈全部打開,這時由于雙鏈打開,熒光染料不發(fā)熒光,這樣熒光值會有一個陡然的突降,借以檢測PCR產(chǎn)物的特異性,相當于進行電泳檢測。因為不同的PCR產(chǎn)物片段其TM值不同,單一的雙鏈DNA其熒光陡降的溫度一致,如果含有非特異性擴增產(chǎn)物,那么其萊光陡降的溫度不止一個(兩個或者更多),說明PCR引物特異性不夠,需要重新設計引物進行標準曲線的制作。如洛解曲線出現(xiàn)單峰則說明引物特異性良化可用于定量檢測。

第三章豬場環(huán)境土壤中細菌多樣性分析及宏基因組測序研究..........40

3.1前言.........40
3.2材料與方法.........40
3.3結(jié)果與分析.........48
3.4討論.........60
3.5小結(jié).........64

第四章宏基因組文庫構(gòu)建篩選豬場環(huán)境土壤中氟苯尼耐藥基因的研究.........66

4.1前言.........66

4.2材料與方法.........66
4.3結(jié)果與分析.........81
4.4討論.........89
4.5小結(jié).........92
第五章結(jié)論.........94

第四章宏基因組文庫構(gòu)建篩選豬場環(huán)境土壤中氟苯尼考耐藥基因的研究

4.1前言

自1990年FFC作為畜禽專用的胺醇類抗生素被批準上市以來,其耐藥基因已在葡萄球菌、大腸桿菌、芽抱桿菌、麻球菌、變形桿菌、假單胞菌等多種常見的可培養(yǎng)細菌中發(fā)現(xiàn)。但目前不可培養(yǎng)的細菌微生物才是地球生物多樣性的重要組成部分,自然生態(tài)環(huán)境中僅有不到1%的微生物可通過實驗室培養(yǎng)的方式獲得而進行相關(guān)研究。以往對于FFC耐藥基因的研究通常都是通過抗性平板篩選耐藥菌的方法進行,這種方法只能對極少部分可培養(yǎng)的細菌進行深入研究。功能宏基因組學是二十世紀末誕生的一項重耍應用學科,可以利用宏基因組文庫的構(gòu)建、高通量測序等技術(shù),繞過傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)環(huán)節(jié),直接從環(huán)境樣品總微生物DNA中篩選已知和未被發(fā)現(xiàn)的功能性基因。近幾年,已有多種已知或未知的氨基糖類及四環(huán)素類等耐藥基因通過構(gòu)建土壤宏基因組文庫被發(fā)現(xiàn)。目前為止,FFC耐藥基因正是通過構(gòu)建fosmid文庫及抗性篩選的方法在阿拉斯加州的小島土壤中被發(fā)現(xiàn)。在國內(nèi),近幾年越來越多的FFC特異性耐藥基因(包括外排聚基因及多重耐藥基因、不斷在豬源細菌中被發(fā)現(xiàn),不過均是通過可培養(yǎng)方法獲得鼻拭子或肛拭子中的耐藥菌株后所進行的研究,而對于構(gòu)建宏基因組文庫直接篩選樣品中FFC耐藥基因的相關(guān)報道甚少,故本研究通過兩種方法構(gòu)建功能宏基因組文庫對豬場環(huán)境土壤中的FFC耐藥基因進行篩選,試圖通過文庫的抗性篩選挖掘土壤微生物中的已知或未知的耐藥基因,為今后對微生物中耐藥基因的研究提供方法借鑒。

4.2材料與方法

以大腸桿菌ATCC25922標準菌株作為質(zhì)控菌,按美國臨床實驗室標準委員會(CLSI)推薦的肉湯微量稀釋法進行。以宿主菌EPI300-T1R作為對照箇株,對文庫中篩選得到的所有氟苯尼考抗性菌株測定其對氟苯尼考的MIC值。按照倍比稀釋法,先在96孔細胞培養(yǎng)板中加入100陣MH肉湯;再將抗菌藥物原液用MH肉湯稀釋到512ng/L,加100陣至96孔細胞培養(yǎng)板第1孔中,依次對前10個孔進行倍比稀釋,使得第1孔的濃度為256ng/曲。然后用MH肉湯將測試菌株稀釋成l005CFU/mL,在每排前10孔各加入稀釋菌液100陣,使得第1孔的藥物濃度為128ng/L。第11孔加l00uL稀釋菌液作為菌液對照,第12孔加100陣MH肉湯作陰性對照,37度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16~2化后,觀察各孔細菌生長情況,抑制細菌生長的最高濃度即為各個菌株的氟苯尼考最小抑菌濃度(MIC),每個轉(zhuǎn)化子做2個平行。對于藥敏試驗的判斷結(jié)果,以CLSI發(fā)布的M31-A3為標準,質(zhì)控菌ATCC25922對氟苯尼考MIC值范圍在2 g/mL即為可信,而目前還沒有關(guān)于其大厥桿菌對于氟苯尼考MIC值的判定標準,因此我們根據(jù)與宿主菌株對氟苯尼考的MIC值相比來判斷轉(zhuǎn)化子是否對氟苯尼考具有耐藥表型。

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第五章結(jié)論

熒光定量PCR研究結(jié)果表明,6個豬場土壤中均呈現(xiàn)不同程度的FRGs污染,尤其是目前所發(fā)現(xiàn)的兩種抗生素可轉(zhuǎn)移的耐藥基因,其中optrA基因在所有豬場土壤中均被檢出,這是繼2015年optrA基因在腸球菌中發(fā)現(xiàn)以來,首次在環(huán)境樣品中檢測到該基因的存在。通過熒光定量結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有豬場土壤樣品中均存在一定程度FRGs污染,而空白土壤未檢測到任何FRGs的存在。另外,從相關(guān)性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)FRGs的整體水平隨豬場FFC使用年限及年均使用量的增加呈升高趨勢,推測FFC在豬場的使用會造成FRGs在周邊環(huán)境菌中的流行,尤其是在人醫(yī)臨床上也受到廣泛關(guān)注的FFC基因。

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參考文獻（略）

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本文編號：169279