發(fā)布時間：2016-10-23 08:19

第一章緒論

多細胞生物是指由兩個或兩個以上分化細胞構(gòu)成的生物體,如植物、動物、藻類和真菌都是多細胞生物。關(guān)于多細胞生物如何產(chǎn)生有著種種假說。共生理論(Symbiosistheory)認為多細胞生物是由多種不同功能的單細胞生物聚集之后偶然完成了生理協(xié)作而成,主要立足于對多細胞生物各功能分化部分的解釋,但存在一系列的遺傳學問題難以解決。群體學說(Colonialtheory)則認為多細胞生物先是由多個單細胞的同種生物聚集起來,或是單個細胞多次分裂后無法相互分離而聚集,之后細胞群體產(chǎn)生分化逐漸形成多細胞生物。以上假設都相對籠統(tǒng),這一問題確實尚無定論,下面從幾個方面展開討論。首先,多細胞生物的第一持征并非是細胞聚集體,而是個體內(nèi)部各個部分的高度分化和分工,任何單一部分都無法獨立地完成對整體的重建。從這一點上可區(qū)分腫瘤及細菌生物膜與多細胞生物,因為腫瘤和生物膜的組成單元雖然可能由于所處相對位置不同而代謝活性有所區(qū)別,但單一的細胞個體取出后仍然可以生成新的腫瘤和生物膜,因此癌細胞和細菌都并非具有高度分化能力的個體,癌細胞是喪失了分化能力的細胞。第二,既然分化性對于多細胞生物如此重要,又從一般演化理論上說"存在即有優(yōu)勢",那么分化的優(yōu)勢是什么呢?這點可從人類社會分工的過程來理解。起初由于生產(chǎn)資料有限,人們靠打獵維持生活,人人只需要學會打獵。隨著生產(chǎn)力的發(fā)展,各種生產(chǎn)方式如種植、畜牧、冶金相繼出現(xiàn),而商品交換直接推動了社會分工。大家為什么不去努為成為全才,把所有技能都學會呢?一是個體精力有限,很難學會所有的技能;二是就算學會的所有的技能也無法全部使用這些技能,因為每種技能都對應著一種生產(chǎn)工具,人們必須首先制備這些生產(chǎn)工具才能完成生產(chǎn),存在很大的成本問題。

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第二章細菌譜行運動的高通量分析

2.1本章概述

早期,人們把細苗戳到瓊脂板的底部,認為這種條件下細菌無法游動,只能依靠菌完成蹭行(圖11(a))。由于拍照技術(shù)的限制,研究者只能得到畫質(zhì)較低的照片,通過測量細菌群落邊界的大小來描述蹭行能為。近年來顯微照相技術(shù)、在線細菌培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展使得對蹲行的原位觀測成為可能,Gibiansky和Jin等人在高速顯微鏡下觀察祿旅桿菌的蹭行過程,同時引入圖像追蹤算法對蹭行的行走和跳躍兩種亞型進行了定量描述。Zhang等人在不同高度的高分子刷表面觀察蹭行過程,發(fā)現(xiàn)高粘度表面跳躍頻率明顯升高[172]。然而,以上的觀測都是針對蹭行運動局部性質(zhì)的研究,欲理解蹭行的宏觀規(guī)律需首先對其進行統(tǒng)計描述和定量分析。我們據(jù)此引入了一套自動化、圖形化輸出的蹭行分析方法,系統(tǒng)地描述細菌蹭行過程中運動速度、運動軌跡和轉(zhuǎn)動情況,同時改變往的實驗方以實現(xiàn)大量運動信息的高效采集,從而最終完成對蹭行運動的宏觀統(tǒng)計描述。本章將從實驗設計、蹲行視頻采集、圖像處理以及數(shù)據(jù)匯總分析和輸出等方面詳細闡述該一方法。

2.2綠賊桿菌在表面上蹭行運動數(shù)據(jù)的高通量獲取

2.2.1細菌培養(yǎng)
我們在實驗中使用的菌種為綠旅桿菌ATCC15692 fliM基因是為了消除細菌鞭毛對蹭行運動的干擾。首先從-80°C冰箱中取出凍存的菌種,在1.5%瓊脂的LB培養(yǎng)板上劃線,放在恒溫培養(yǎng)箱中37°C解育18小時。待長出菌斑后,挑一個單克隆菌斑接種于1ml限制性培養(yǎng)基FAB+30mM谷氨酸,在37。200rpm轉(zhuǎn)速下?lián)u菌培養(yǎng)10小時。在對數(shù)期約00600 0.8左右收集細菌,按體積比1:1稀釋到1ml新鮮的FAB中。

第三章細菌蹭行運動的多樣性及環(huán)境響應性......79

3.1本章概述......79
3.2細菌蹭行運動的多樣性及分類......79
3.3不同養(yǎng)料環(huán)境對細菌表面爬行行為的影響......85
第四章蹲行運動模型的建立及模擬......99
4.1本章概述......99
4.2運動模型的建立......99
4.3運動模型的計算機模擬......103
第五章銅綠假單胞菌表面感知機制的研究......117
5.1本章概述......117
5.2實驗結(jié)果......119
5.3實驗方法和步驟........126

第四章蹭行運動模型的建立及模擬

4.1本章概述

從第三章可知,在蹭行運動過程中細菌的運動速度和軌跡的平滑程度呈明顯的正相關(guān),而且貫穿始終的多樣性是該過程最為明確不可回避的特征。怎樣理解和解釋這種正相關(guān)性以及多樣性成為理解蹭行運動的關(guān)鍵,本章將圍繞這一問題做仔細的探討。我們首先嘗試建立一個基于細菌胞內(nèi)FimX蛋白分布的理論運動模型,闡述細菌運動速度和軌跡形狀的關(guān)聯(lián)性以及多樣化運動產(chǎn)生的分子內(nèi)因。該模型假設分布于細菌兩極的菌毛相互競爭地將細茵拉向相反方向,而FimX的布決定兩極菌毛的活躍程度。我們從已有的細菌運動數(shù)據(jù)中抽提出菌毛動作的統(tǒng)計數(shù)據(jù),再按照蒙恃卡洛抽樣模式的方法模式細菌在表面上的運動,通過對FimX表達量參數(shù)7和對稱性參數(shù)片的調(diào)節(jié),完全重現(xiàn)了細菌的多樣性蹭行過程。然后,我們從保險假設的角度去理解蹭行運動保持多樣性的演化內(nèi)因。我們假設蹭行運動具有尋找資源和聚集成巧的兩相功能,運動快的細菌在尋找新的資源、占有新的領(lǐng)地方面擁有優(yōu)勢,而運動慢的細菌更能在一個生長條件比較優(yōu)越的環(huán)境中聚集,進而成為生命力更強的生物膜形式的存在。這樣,多樣性的運動提供了一個雙保險,使細菌在漫長的演化史上很好地適應快速變化的外界環(huán)境。最后,我們?nèi)匀煌ㄟ^計算機模擬的方法,解析出不同7和片情況下細菌搜素養(yǎng)料和形成聚集體的能力,驗證保險假設的猜想。

4.2運動模型的建立

銅綠假單胞菌單個細菌也包含多根菌毛,不同于淋球菌的是綠銅綠假單胞菌為長圓形,其菌毛并非周身分布,而是位于長軸的兩端且均可拉動細菌。在菌毛的后方有兩個極為關(guān)鍵的馬達, PilB使菌毛蛋白單元PilA聚合伸出胞外,而PilT則將PilA解聚合使菌毛收縮。N1T和PilB均為ATP水解酶,通過消耗ATP得到能量,然后供給細菌運動。在PilB的后方則有PilZ和FimX,調(diào)節(jié)PilB的功能,第三章中已經(jīng)證實FimX的胞內(nèi)分布決定著蹭行運動的方向。

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第五章銅綠假單胞菌表面感知機制的研究

5.1本章概述

第一章中己經(jīng)介紹,研究細菌的表面感知機制即是研究細菌梢附到表面后如何完成表型轉(zhuǎn)變,從活躍游動的浮游狀態(tài)變?yōu)樯锬さ臓钪��；蛟S有人認為表面感知或浮游態(tài)-表面態(tài)轉(zhuǎn)變是一個偽命題,細菌粘附表面之后只是自然地生長、増多,最后堆在一起而己。然而,多項實驗表明生物膜內(nèi)細菌的表型確己發(fā)生明顯改變。例如以hiteky等人用微陣列方法測量銅緑假單胞菌生物膜內(nèi)部基因表達情況發(fā)現(xiàn),雖然絕大多數(shù)基因表達水平基本不變,但有約1%的基因表達明顯上升或下降;生物膜中的胞外聚合物干重所占比例通常很高,可見生物膜中細菌分泌多糖、胞外蛋白等的能力也強于浮游態(tài)細菌。那么,浮游態(tài)-表面態(tài)轉(zhuǎn)變的具體過程是什么?這一問題包括兩點:一是細菌通過哪套系統(tǒng)響應了哪種表面信號?二是響應外界信號后細菌經(jīng)歷哪種信號通路調(diào)節(jié)表型的轉(zhuǎn)變?

5.2實驗結(jié)果

Christen等在實驗中將sensor克隆在質(zhì)粒上并以tac啟動子控制sensor的轉(zhuǎn)錄,在iptg誘導條件下觀察FRET信號。以上方法在長時間的生物膜跟蹤檢測中遇到兩個問題:一是中等濃度iptg誘導下各細菌之間sensor表達量不均勻,表達量太低的細菌數(shù)據(jù)分析噪音較大;二是質(zhì)粒在細菌中的拷貝數(shù)不穩(wěn)定,必須始終保持抗生素張力環(huán)境才能防止質(zhì)粒丟失,而我們則希望盡量避免引入額外的條件。我們首先利用miniTn基因重組系統(tǒng)將sensor基因片段重組到銅綠假單胞菌基因組上的固定位置,并分別嘗試用結(jié)構(gòu)性后動子如lac、tac、PA10403以及人工合成的結(jié)構(gòu)性啟動子等控制sensor基因的轉(zhuǎn)錄,以此實現(xiàn)將sensor基因在細菌中以單拷貝的方式穩(wěn)定表達。如圖5.3所示為各啟動子下sensor在細菌中表達的英光信號我們最終選擇信噪比較好的PA10403-sensor系統(tǒng)進行后續(xù)實驗。

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參考文獻（略)

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本文編號：150071