本文關(guān)鍵詞：牛支原體LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β釋放的分子機制研究

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【摘要】：牛支原體(Mycoplasma bovis,M.bovis)感染引起的犢牛肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳房炎、角膜炎等與牛支原體相關(guān)的疾病簡稱為牛支原體相關(guān)疾病(Mycoplasma bovis-associated disease,Mb AD)。Mb AD是引起我國養(yǎng)牛場中犢牛死亡的主要疾病之一,但是牛支原體的致病性及致病機制尚不十分清楚。天然免疫應(yīng)答是脊椎動物對抗入侵的外界微生物的第一道防線。天然免疫細胞主要包括上皮細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞等。作為宿主天然免疫細胞的重要一員,上皮細胞通過直接清除病原微生物和釋放相應(yīng)的細胞因子和趨化因子來招募其它免疫細胞到感染部位來發(fā)揮其免疫學(xué)功能。肺臟是牛支原體感染的靶器官,研究肺上皮細胞對抗牛支原體及其重要毒力蛋白的免疫應(yīng)答,可以幫助我們理解宿主細胞的防御策略和相應(yīng)的牛支原體的逃避策略。胎牛肺細胞(embryonic bovine lung cell,EBL cell)是用懷胎7個月左右的胎牛肺組織建立的一種原代細胞。該細胞是研究牛的病毒性、細菌性疾病的重要細胞模型。支原體膜表面存在著大量的脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)。支原體LAMPs是介導(dǎo)支原體粘附宿主、入侵宿主的基礎(chǔ)。同時,支原體LAMPs能夠與細胞膜表面受體結(jié)合,激發(fā)宿主細胞因子的釋放。在本研究中,以EBL細胞為細胞模型,研究宿主在牛支原體LAMPs刺激下釋放IL-1β的分子機制。1.牛天然免疫信號通路關(guān)鍵分子的克隆及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建克隆牛NF-κB信號通路及上游Toll-like receptor信號通路中關(guān)鍵信號分子TLR1,TLR2,My D88,IRAK4和p65,并構(gòu)建其重組質(zhì)粒:p CMV-HA-TLR1;p CMV-HA-TLR2;p CMV-HA-My D88;p CMV-HA-IRAK4和p EGFP-p65等,為后文牛支原體LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β釋放的分子機制研究提供工具。2.牛支原體LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β釋放的分子機制研究以EBL細胞為細胞模型,將一定量的熱致死的M.bovis和活的M.bovis分別刺激EBL細胞,應(yīng)用SYBR Green I Real-time PCR檢測EBL細胞IL-1β的表達水平。結(jié)果證實,活的M.bovis及熱致死的M.bovis均能夠誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β的產(chǎn)生。另一方面,應(yīng)用牛支原體LAMPs刺激EBL細胞,發(fā)現(xiàn)牛支原體LAMPs也能夠誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β的產(chǎn)生,且呈時間及劑量依賴。進一步,應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡和Western Blotting技術(shù),證實,牛支原體LAMPs能夠誘導(dǎo)EBL細胞轉(zhuǎn)錄因子p65轉(zhuǎn)核從而激活NF-κB信號通路,誘導(dǎo)下游IL-1β的釋放,且跨膜受體TLR2在此過程中發(fā)揮著重要的作用。
【關(guān)鍵詞】：牛支原體 脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(LAMPs) 胎牛肺細胞 NF-κB信號通路 IL-1β
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S852.62
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-19
• 1.1 牛支原體（Mycoplasma bovis）簡介13
• 1.2 牛支原體的流行病學(xué)13-14
• 1.3 牛支原體的臨床癥狀和病理變化14
• 1.4 牛支原體的鑒別診斷14-15
• 1.4.1 M.bovis的分離培養(yǎng)14-15
• 1.4.2 M.bovis的血清學(xué)診斷15
• 1.4.3 M.bovis的分子生物學(xué)診斷15
• 1.5 牛支原體相關(guān)疾病的防治15-16
• 1.6 牛支原體脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白(lipid-associated membrane proteins,LAMPs)誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的研究16-18
• 1.7 本研究的目的和意義18-19
• 第二章 關(guān)鍵信號分子的擴增及其重組質(zhì)粒的構(gòu)建19-27
• 2.1 材料19
• 2.1.1 菌株、質(zhì)粒、細胞及實驗動物19
• 2.1.2 主要試劑19
• 2.1.3 主要設(shè)備儀器19
• 2.2 方法19-23
• 2.2.1 引物的設(shè)計與合成19-20
• 2.2.2 EBL細胞的培養(yǎng)及cDNA的制備20-21
• 2.2.3 目的基因的擴增21
• 2.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定21
• 2.2.5 重組質(zhì)粒pET-30a-p65（N端 666bp）的轉(zhuǎn)化及誘導(dǎo)表達21-22
• 2.2.6 重組p65（N端 666bp）可溶性判斷22
• 2.2.7 重組p65（N端 666bp）的純化22
• 2.2.8 抗p65（N端 666bp）蛋白小鼠陽性血清的制備22
• 2.2.9 小鼠抗p65（N端 666bp）蛋白陽性血清的Western Blotting驗證22-23
• 2.3 結(jié)果23-26
• 2.3.1 目的基因的擴增結(jié)果23
• 2.3.2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定結(jié)果23-24
• 2.3.3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果24
• 2.3.4 序列測定結(jié)果24
• 2.3.5 重組p65（N端 666bp）的誘導(dǎo)及可溶性判定24-25
• 2.3.6 重組p65（N端 666bp）的純化結(jié)果25
• 2.3.7 小鼠抗p65（N端 666bp）蛋白的陽性血清的Western Blotting檢測25-26
• 2.4 小結(jié)26-27
• 第三章 牛支原體的LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β 釋放的分子機制研究27-36
• 3.1 材料27-28
• 3.1.1 菌株、細胞和質(zhì)粒27
• 3.1.2 主要試劑27
• 3.1.3 主要設(shè)備27-28
• 3.2 方法28-30
• 3.2.1 M.bovis的培養(yǎng)及其LAMPs的提取28
• 3.2.2 SYBR Green I實時定量PCR及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染28
• 3.2.3 SYBR Green I Real-time PCR檢測M.bovis刺激EBL細胞IL-1β 表達情況28-29
• 3.2.4 SYBR Green I Real-time PCR檢測LAMPs刺激EBL細胞IL-1β 釋放的最佳時間和最佳劑量29
• 3.2.5 ELISA方法檢測LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β 的釋放量29
• 3.2.6 激光共聚焦顯微鏡檢測LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞p65轉(zhuǎn)核29
• 3.2.7 Western Blotting檢測LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞p65轉(zhuǎn)核29-30
• 3.2.8 SYBR Green I Real-time PCR檢測NF-κB活性被抑制后LAMPs刺激EBL細胞IL-1β 表達情況30
• 3.2.9 SYBR Green I Real-time PCR檢測TLR2對LAMPs刺激的EBL細胞IL-1β 表達水平的影響30
• 3.3 結(jié)果30-34
• 3.3.1 SYBR Green I Real-time PCR檢測M.bovis刺激EBL細胞IL-1β 表達情況30-31
• 3.3.2 SYBR Green I Real-time PCR檢測LAMPs刺激EBL細胞IL-1β 表達的最佳時間和最佳劑量31
• 3.3.3 ELISA方法檢測LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞IL-1β 的釋放量31-32
• 3.3.4 激光共聚焦顯微鏡檢測LAMPs誘導(dǎo)EBL細胞p65轉(zhuǎn)核32-33
• 3.3.5 Western Blotting證明LAMPs能夠誘導(dǎo)EBL細胞p65轉(zhuǎn)核33
• 3.3.6 SYBR Green I Real-time PCR證明NF-κB活性被抑制后LAMPs刺激EBL細胞IL-1β 表達下調(diào)33-34
• 3.3.7 SYBR Green I Real-time PCR檢測TLR2對LAMPs刺激的EBL細胞IL-1β 表達水平的影響34
• 3.4 小結(jié)34
• 3.5 討論34-36
• 第四章 結(jié)論36-37
• 參考文獻37-43
• 致謝43-44
• 作者簡介44

【參考文獻】

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中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周玉梅;絲狀支原體絲狀亞種P19蛋白粘附特性的研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2014年

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本文編號：939520