本文關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌體免疫納米抗體庫(kù)構(gòu)建及抗Cap納米抗體的篩選

  更多相關(guān)文章： 豬圓環(huán)病毒II型(PCV2) 噬菌體展示抗體庫(kù) 納米抗體(VHH) Cap

【摘要】：豬圓環(huán)病毒II型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是引起PCV2相關(guān)疾病(PCV2-associated diseases,PCVAD)的主要病原。PCVAD目前呈世界范圍內(nèi)廣泛流行,給全世界養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。PCV2為單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒,也是目前已知最小動(dòng)物病毒,Cap蛋白為PCV2唯一結(jié)構(gòu)蛋白,同時(shí)也是臨床上PCVAD預(yù)防和診斷的主要靶標(biāo)。PCV2的快速檢測(cè)是預(yù)防PCVAD的重要手段之一。為建立快速有效的PCV2血清學(xué)檢測(cè)方法,本研究以商品化PCV2亞單位疫苗為免疫原免疫雙峰駝,構(gòu)建駱駝重鏈可變區(qū)抗體(Single-domain variable heavy chain antibody,VHH or nanobodies)噬菌體免疫庫(kù)。以原核表達(dá)的PCV2 Cap病毒樣顆粒(viral like particles,VLPs)為抗原,生物淘洗篩選針對(duì)PCV2 Cap的VHHs,為PCV2抗原檢測(cè)提供高質(zhì)量抗體。本研究?jī)?nèi)容分為3部分:1.篩選用抗原制備構(gòu)建表達(dá)Cap蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pET32a-SUMO-Cap。轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)并純化重組Cap蛋白,經(jīng)SUMO蛋白酶Ulp酶切裂解和Ni2+親和樹(shù)脂純化后獲得無(wú)任何多余氨基酸的Cap蛋白。進(jìn)一步經(jīng)透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),無(wú)多余氨基酸的PCV2Cap蛋白能在體外自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)。2.構(gòu)建文庫(kù)用噬菌粒的改造以商品化噬菌粒pCANTAB5E為載體骨架,通過(guò)Linker引入,將pCANTAB5E載體上用于VHH文庫(kù)插入的Sfi I、Not I雙酶切位點(diǎn)變成兩個(gè)識(shí)別序列不同的Sfi I酶切位點(diǎn)。在兩個(gè)Sfi I酶切位點(diǎn)之間進(jìn)一步引入CAT/Ccdb正負(fù)篩選標(biāo)簽。獲得構(gòu)建VHH文庫(kù)用噬菌粒pCANTAB5E-Ccdb-cm�？寺⌒蕶z測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),改造后的pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒與商品化噬菌粒pCANTAB5E相比,顯著提高了VHH的克隆效率。3.利用PCV2商品化亞單位疫苗免疫雙峰駝,免疫5次后,分離外周血淋巴細(xì)胞,提取總RNA反轉(zhuǎn)錄后,兩步法擴(kuò)增獲得VHH庫(kù)。將擴(kuò)增的VHH庫(kù)與pCANTAB5E-Ccdb-cm噬菌粒經(jīng)Sfi I酶切后,連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞,成功構(gòu)建了可用于Cap蛋白VHH淘篩的VHH噬菌體初級(jí)庫(kù)(庫(kù)容6×106,插入率100%,多樣性豐富)。以Cap VLPs為淘篩抗原,通過(guò)4輪淘篩和phage-ELISA檢測(cè),獲得了4株反應(yīng)性較好的VHHs。本研究構(gòu)建了PCV2噬菌體免疫納米抗體庫(kù),并篩選到了4株具有抗Cap活性的VHHs,為以VHH抗體為基礎(chǔ)的PCV2抗原檢測(cè)試劑盒研發(fā)和PCV2致病機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：豬圓環(huán)病毒II型(PCV2) 噬菌體展示抗體庫(kù) 納米抗體(VHH) Cap
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-27
• 1.1 噬菌體展示技術(shù)研究進(jìn)展13-19
• 1.1.1 絲狀噬菌體結(jié)構(gòu)和生活史13-15
• 1.1.2 噬菌體文庫(kù)的構(gòu)建15-16
• 1.1.3 淘篩16-17
• 1.1.4 噬菌體展示技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀17-19
• 1.2 豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）研究概況19-24
• 1.2.1 PCV2遺傳型和抗性19-20
• 1.2.2 易感類(lèi)群和傳播途徑20
• 1.2.3 病毒生活史及致病機(jī)制20
• 1.2.4 PCVAD20-21
• 1.2.5 PCV2衣殼蛋白Cap21-22
• 1.2.6 目前可以使用的商業(yè)化疫苗22-23
• 1.2.7 試驗(yàn)性PCV2疫苗23-24
• 1.2.8 病毒樣顆粒（VLP）疫苗24
• 1.3 納米抗體及其在診斷上的應(yīng)用24-26
• 1.4 本研究的目的和意義26-27
• 試驗(yàn)研究27-61
• 第二章 噬菌粒載體的改造及Cap的病毒樣顆粒的制備27-46
• 2.1 試驗(yàn)材料27-28
• 2.1.1 菌株與質(zhì)粒27
• 2.1.2 主要試劑及儀器27
• 2.1.3 主要溶液27-28
• 2.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成28
• 2.2 方法28-36
• 2.2.1 pCANTAB5E-linker載體的構(gòu)建28-30
• 2.2.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm載體的構(gòu)建30-32
• 2.2.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比較32
• 2.2.4 pET32a-SUMO-Cap表達(dá)載體的構(gòu)建32-33
• 2.2.5 重組Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)33
• 2.2.6 重組Cap蛋白的大量表達(dá)與純化33-34
• 2.2.7 SUMO蛋白酶Ulp的表達(dá)與純化34-35
• 2.2.8 His-SUMO-Cap融合蛋白的酶切與純化35
• 2.2.9 Cap的病毒樣顆粒的鑒定35-36
• 2.3 結(jié)果與分析36-44
• 2.3.1 pCANTAB5E-linker載體的構(gòu)建36-38
• 2.3.2 pCANTAB5E-Ccdb-Cm載體的構(gòu)建38-39
• 2.3.3 pCANTAB5E-Ccdb-Cm和pCANTAB5E-Scfv克隆效率比較39-41
• 2.3.4 重組Cap蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)41
• 2.3.5 重組Cap蛋白的純化與濃縮41-42
• 2.3.6 SUMO蛋白酶Ulp的表達(dá)與純化42-43
• 2.3.7 His-SUMO標(biāo)簽的去除及酶切純化43
• 2.3.8 Cap蛋白的Western Blotting分析43-44
• 2.3.9 VLPs形成的鑒定44
• 2.4 討論44-45
• 2.5 小結(jié)45-46
• 第三章 噬菌體展示抗體庫(kù)的構(gòu)建和特異性抗體的篩選46-61
• 3.1 試驗(yàn)材料46
• 3.1.1 菌株與質(zhì)粒46
• 3.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及疫苗46
• 3.1.3 主要試劑46
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備46
• 3.1.5 主要培養(yǎng)基的配置46
• 3.2 方法46-54
• 3.2.1 動(dòng)物免疫46-47
• 3.2.2 淋巴細(xì)胞的分離47
• 3.2.3 淋巴細(xì)胞總RNA的提取47
• 3.2.4 VHH片段的擴(kuò)增47-48
• 3.2.5 載體和VHH片段的兩步酶切48-49
• 3.2.6 VHH抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定49-52
• 3.2.7 特異性抗體的淘選52-53
• 3.2.8 Phage ELISA鑒定抗原陽(yáng)性重組抗體53-54
• 3.3 結(jié)果與分析54-59
• 3.3.1 淋巴細(xì)胞分離與RNA提取54-55
• 3.3.2 VHH基因的擴(kuò)增55
• 3.3.3 載體和VHH片段的兩步酶切55-56
• 3.3.4 抗體庫(kù)的構(gòu)建和插入率檢測(cè)56-57
• 3.3.5 抗體庫(kù)的豐度和多樣性鑒定57-58
• 3.3.6 抗體庫(kù)的淘選58-59
• 3.4 討論59
• 3.5 小結(jié)59-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-72
• 附錄72-76
• 致謝76-77
• 作者簡(jiǎn)介77

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 王剛,王琰,化冰,劉曉琳,喬媛媛;人源性天然抗體庫(kù)的構(gòu)建及初步鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2002年01期

2 劉強(qiáng);張晶;張小愛(ài);楊小盼;華玲;高新;付潔;宋海峰;;分泌型畢赤酵母人全長(zhǎng)抗體庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年01期

3 黃家強(qiáng);新一代治療用抗體——改型抗體[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(分子生物學(xué)分冊(cè));1997年02期

4 黨育平,張亮,武彩霞;應(yīng)用定量免疫印跡技術(shù)分析人類(lèi)自身反應(yīng)抗體庫(kù)[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(免疫學(xué)分冊(cè));2002年04期

5 武文;李勝華;張偉京;王炳奇;;抗脂多糖納米抗體的篩選及其五聚體的制備[J];生物技術(shù)通訊;2013年05期

6 喬媛媛,王琰,陳曉穗,王欲曉,化冰;大容量噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建及鑒定[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;2004年03期

7 張霞;李杰;郭巍;李國(guó)勛;;一種從多克隆抗體庫(kù)快速分離高特異性抗體的方法[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2008年05期

8 涂追;許楊;劉夏;何慶華;陶勇;;駝源天然單域重鏈抗體庫(kù)的構(gòu)建與鑒定[J];中國(guó)生物工程雜志;2011年04期

9 王琰,化冰,劉群英,高榮凱,朱迎春,陳宇萍;隨機(jī)化CDR3抗體庫(kù)的構(gòu)建及不經(jīng)免疫制備抗體的初步探索[J];中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志;1997年06期

10 包國(guó)強(qiáng),馬慶久,邢金良,楊向民,陳志南;人源噬菌體Fab抗體庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中引物的優(yōu)化和初步鑒定[J];免疫學(xué)雜志;2004年03期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 王剛;劉玉峰;;人天然抗體庫(kù)的構(gòu)建及抗角蛋白抗體的篩選[A];2002中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2002年

2 栗利芳;索勛;盛僅滿(mǎn);;伊氏錐蟲(chóng)抗體庫(kù)的初步建立與效果檢測(cè)[A];中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)第八次全國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要匯編[C];2001年

3 韋曉明;蘇明權(quán);楊安鋼;溫偉紅;郝曉柯;;人抗體Fab段天然抗體庫(kù)的建立[A];第五次全國(guó)中青年檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 陳志南;李玲;;基于抗體的生物制藥與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究[A];第五次全國(guó)免疫診斷暨疫苗學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2011年

5 杜曉明;方佩華;李寧;;人源性促甲狀腺素抗體Fab片段抗體庫(kù)的構(gòu)建篩選、鑒定[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

6 劉國(guó)振;劉斯奇;吳琳;;水稻抗體庫(kù)及基于抗體的蛋白質(zhì)組學(xué)[A];植物分子生物學(xué)與現(xiàn)代農(nóng)業(yè)——全國(guó)植物生物學(xué)研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

7 韋曉明;蘇明權(quán);楊安鋼;溫偉紅;郝曉柯;;人抗體Fab段天然抗體庫(kù)的建立[A];第九屆西北五�。▍^(qū)）檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2005年

8 杜曉明;方佩華;李寧;;人源性促甲狀腺素抗體Fab片段抗體庫(kù)的構(gòu)建篩選、鑒定[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)核醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2011年

中國(guó)重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前5條

1 本報(bào)記者 王飛雁;義翹神州：做全球最大的抗體庫(kù)[N];北京日?qǐng)?bào);2011年

2 馮衛(wèi)東;美發(fā)現(xiàn)將骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)成腦細(xì)胞的抗體[N];科技日?qǐng)?bào);2013年

3 通訊員 劉超 記者 程守勤;可“封鎖”H5N1病毒的抗體研制成功[N];健康報(bào);2013年

4 記者　姜云飛;海歸博士欲建抗體“世界工廠(chǎng)”[N];大連日?qǐng)?bào);2006年

5 本報(bào)記者 莊光平;京天成：讓科研與市場(chǎng)比翼齊飛[N];經(jīng)濟(jì)日?qǐng)?bào);2012年

中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 焦永軍;人源Na（？）ve Fab抗體庫(kù)的構(gòu)建和抗Met抗體片斷的篩選及特征鑒定[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 劉丹丹;豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（PCV2）噬菌體免疫納米抗體庫(kù)構(gòu)建及抗Cap納米抗體的篩選[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

2 傅文燕;新型全人抗HER2抗體的制備、優(yōu)化、及抗腫瘤作用研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

3 何鮮;抗人肺泡表面活性蛋白A納米抗體的制備及其靶向性的檢測(cè)[D];蘇州大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：929460