本文關(guān)鍵詞：梨‘中矮1號’矮生基因的篩選及PcAHS克隆與表達(dá)分析

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【摘要】：‘中矮1號’是從‘錦香’梨實(shí)生后代中選出的優(yōu)良梨矮化砧木。樹體矮小緊湊,作砧木促進(jìn)樹體矮化,但其矮生和致矮機(jī)理尚不清楚。以‘中矮1號’及‘錦香’新梢嫩葉為試材,進(jìn)行RNA-Seq分析,共獲得2個品種46619個unigenes,其中長度大于1000 bp占23.25%,約71%的unigenes至少具有1條注釋。使用IDE6軟件對基因進(jìn)行表達(dá)分析,控制FDR低于0.05,并且基因的最高表達(dá)量達(dá)到最低表達(dá)量的1.5倍時,該基因?yàn)椴町惐磉_(dá)基因。‘中矮1號’和‘錦香’中存在很多個差異表達(dá)的基因,有些可以作為矮化相關(guān)的候選基因,包括1個編碼GA-3氧化酶基因,5個編碼生長素相關(guān)蛋白基因,4個編碼細(xì)胞色素P450蛋白基因,1個編碼類LRR受體絲氨酸/蘇氨酸激酶基因;2個編碼脫落酸合成酶基因,3個編碼乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因,6個編碼水分相關(guān)蛋白基因,2個NAC類轉(zhuǎn)錄因子和4個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因。從中選取10個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證,結(jié)果表明qRT-PCR結(jié)果與RNA-Seq結(jié)果一致。在上述差異表達(dá)的基因中,有1個注釋為生長素氫轉(zhuǎn)運(yùn)體的基因在‘中矮1號’中為低表達(dá),可能限制生長素的極性運(yùn)輸而導(dǎo)致‘中矮1號’矮生。因此,根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果,設(shè)計(jì)特異性引物,分別在‘中矮1號’和‘錦香’中克隆到了該基因序列。其全長1 239 bp,在2個品種間沒有序列差異,均編碼412個氨基酸,其氨基酸序列與蘋果(NM_001293843.1)、梅(xp_008242099.1)、毛果楊(xp_002306421.2)、草莓(xp_004287713.1)的生長素氫轉(zhuǎn)運(yùn)體基因氨基酸序列的相似性在67%~99%之間,將其命名為PcAHS。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),在新梢旺盛生長期,PcAHS基因在‘中矮1號’新梢韌皮部中的表達(dá)量均低于母本‘錦香’,推測二者啟動子序列可能存在差異。分別克隆了‘中矮1號’及其母本‘錦香’PcAHS基因上游啟動子序列片段,長度分別為828 bp和888 bp,二者相似性為89.1%。序列分析發(fā)現(xiàn)‘中矮1號’PcAHS基因啟動子上有一段58 bp(-496 bp~-553 bp)的缺失;利用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫PLACE和PLANTCARE分析表明,2個品種啟動子上除了含有TATA-box、CAAT-box等共有的轉(zhuǎn)錄必需調(diào)控元件外,‘中矮1號’中還含有一個‘錦香’沒有的BPBF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的P-box元件。推測‘中矮1號’PcAHS基因啟動子上所特有的P-box轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件和片段缺失可能是導(dǎo)致其表達(dá)量低的原因,并通過影響生長素的運(yùn)輸最終引起生長發(fā)育變化。
【關(guān)鍵詞】：梨 矮生 轉(zhuǎn)錄組 生長素氫轉(zhuǎn)運(yùn)體 基因表達(dá)與分析
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S661.2;Q943.2
【目錄】：

• 摘要6-7
• 英文摘要7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-21
• 1.1 研究背景13-14
• 1.2 矮化機(jī)理的研究進(jìn)展14-17
• 1.2.1 解刨特性與樹體矮化14-15
• 1.2.2 同化物、礦質(zhì)營養(yǎng)和水勢與樹體矮化15
• 1.2.3 主要氧化酶類與矮化的關(guān)系15-16
• 1.2.4 內(nèi)源激素與樹體矮化16
• 1.2.5 植株矮化遺傳分析與基因調(diào)控16-17
• 1.2.6 木本植物矮化研究中存在的問題17
• 1.3 轉(zhuǎn)錄組含義17-18
• 1.4 轉(zhuǎn)錄組測序的應(yīng)用18
• 1.5 轉(zhuǎn)錄組測序的步驟18-20
• 1.6 分析流程20
• 1.7 本實(shí)驗(yàn)的目的意義20-21
• 第二章 梨矮化相關(guān)基因分離21-35
• 2.1 試驗(yàn)材料21
• 2.2 試驗(yàn)方法21-24
• 2.2.1 RNA的提取21
• 2.2.2 cDNA文庫構(gòu)建21
• 2.2.3 測序21-22
• 2.2.4 序列組裝22
• 2.2.5 微衛(wèi)星的探測與功能注釋22
• 2.2.6 轉(zhuǎn)錄組差異基因22
• 2.2.7 qRT-PCR22-24
• 2.3 結(jié)果與分析24-33
• 2.3.1‘中矮1號’與‘錦香’枝條發(fā)育情況24-26
• 2.3.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)與分析26-31
• 2.3.3 qPCR分析31-33
• 2.4 討論33-35
• 第三章‘中矮1號’梨PcAHS基因及其啟動子克隆與分析35-43
• 3.1 試驗(yàn)材料35
• 3.2 試驗(yàn)方法35-37
• 3.2.1 總的RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄35
• 3.2.2 PcAHS基因的克隆35-36
• 3.2.3 氨基酸同源性序列分析36
• 3.2.4 PcAHS基因的RT-PCR分析36
• 3.2.5 PcAHS基因的啟動子克隆36
• 3.2.6 PcAHS基因啟動子區(qū)域比對及順式作用元件分析36-37
• 3.3 結(jié)果與分析37-41
• 3.3.1 PcAHS基因克隆與分析37-38
• 3.3.2 PcAHS基因的表達(dá)分析38
• 3.3.3 PcAHS基因啟動子克隆與分析38-41
• 3.4 討論41-43
• 第四章 全文結(jié)論43-44
• 參考文獻(xiàn)44-51
• 致謝51-52
• 作者簡歷52

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：799046