本文關(guān)鍵詞：3株禽2型副黏病毒的分離鑒定與生物學(xué)特性初步分析

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【摘要】：副黏病毒是在人和動(dòng)物中廣泛存在的一類病毒,其中的一些成員可以引起人和動(dòng)物的嚴(yán)重發(fā)病,造成嚴(yán)重的公共衛(wèi)生事件及重大的經(jīng)濟(jì)損失。2013年,在黑龍江省開展的野鳥中禽流感病毒的監(jiān)測(cè)中,我們?cè)诖笈d安嶺及綏棱兩個(gè)地區(qū)的野鳥樣品中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)有血凝活性,卻不含禽流感和新城疫病毒的樣品,為鑒定這些樣品中可能存在的病原,我們開展了以下實(shí)驗(yàn):首先,收集3個(gè)樣品尿囊液及利用差速離心法處理后,分別取出100μL制備電子顯微鏡負(fù)染色樣品并在電鏡下觀察。在這3個(gè)樣品中均觀察到副黏病毒樣粒子:直徑為150~200 nm,有囊膜且可見線性核酸。隨后,分別提取了這些樣品的核酸,利用隨機(jī)引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序,分析結(jié)果顯示3個(gè)樣品均含與禽2型副黏病毒基因組片段有較高的相似性(71~92%)的基因片段,表明3個(gè)樣品中所含的病毒粒子與禽2型副黏病毒存在同源性。為進(jìn)一步鑒定這些病毒,我們將3個(gè)樣品并分別與NDV和APMV-2多克隆抗體進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn),結(jié)果表明NDV陽性血清對(duì)3個(gè)病毒有低的抑制活性(23)而APMV-2多克隆抗體對(duì)3個(gè)抗原物質(zhì)有較高的血凝抑制活性(29)。通過以上實(shí)驗(yàn),我們初步鑒定這3株病毒為禽2型副黏病毒,并分別命名為APMV-2/Emberiza spodocephala/China/Daxing’anling/974/2013(APMV-2/Daxing’anling/974),APMV-2/Procarduelis nipalensis/China/Suiling/53/2013(APMV-2/Suiling/53),及APMV-2/Anthus ruf ulus/China/Suiling/106/2013(APMV-2/Suiling/106)。由于我國還沒有有關(guān)野鳥中禽2型副黏病毒的報(bào)道,我們對(duì)這3株病毒的全基因組進(jìn)行了測(cè)定。根據(jù)Gen Bank中下載的2型副黏病毒的基因組序列及隨機(jī)擴(kuò)增的結(jié)果,設(shè)計(jì)了對(duì)這3株病毒全基因組測(cè)序的引物,對(duì)其基因組序列進(jìn)行了測(cè)定。測(cè)序結(jié)果表明3株病毒基因組序列全長(zhǎng)均為15000 nt,按照5'-N-P-M-F-HN-L-3'順序編碼六個(gè)非重疊基因,基因組全長(zhǎng)遵循“六拷貝原則”。這3株分離株的全基因組序列與其他禽2型副黏病毒的基因組序列相似性為75.8~80.2%,與APMV-2/Bangor相似性最高,基因3'端存在55 nt leader,5'端存在161 nt的trailer。3株病毒的P基因均存在m RNA編輯位點(diǎn)“A5G4”,通過m RNA編輯時(shí)在編輯位點(diǎn)G序列中插入1個(gè)G產(chǎn)生V蛋白或插入2個(gè)G從而產(chǎn)生W蛋白。三株病毒的N、P、M、F、L基因與其它6株2型副黏病毒(NK、F8、Yucaipa、England、Kenya、Bangor)的相應(yīng)基因相似性最高的是Bangor,而HN基因相似性最高的是Kenya。將這3株病毒全基因組與本科中其它屬代表毒株全基因組進(jìn)行進(jìn)化樹分析顯示此3株病毒與其它已知的6株病毒在進(jìn)化上處于同一分支。為評(píng)估這3株病毒的致病性,我們選擇APMV-2/Suiling/53進(jìn)行了動(dòng)物試驗(yàn)。經(jīng)測(cè)定APMV-2/Suiling/53的雞胚平均致死時(shí)間(MDT)為120 h,其腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)為零;SPF雞和小鼠的感染試驗(yàn)表明,APMV-2/Suiling/53對(duì)SPF雞呈低致病力而對(duì)BALB/c小鼠無致病性。本實(shí)驗(yàn)通過形態(tài)學(xué)觀察、核酸分析與血凝抑制試驗(yàn)鑒定了3株禽2型副黏病毒,并對(duì)其全基因組和致病性進(jìn)行了初步分析。研究結(jié)果為禽副黏病毒遺傳多樣性及致病性研究提供了基礎(chǔ)資料。
【關(guān)鍵詞】：禽2型副黏病毒 分離鑒定 基因組分析 致病性
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文縮略表12-13
• 第一章 引言13-18
• 1.1 副黏病毒簡(jiǎn)介13
• 1.2 禽副黏病毒粒子結(jié)構(gòu)及其編碼蛋白13-15
• 1.2.1 核衣殼蛋白14
• 1.2.2 磷酸化蛋白14
• 1.2.3 基質(zhì)蛋白14
• 1.2.4 融合蛋白14-15
• 1.2.5 血凝素-神經(jīng)氨酸酶15
• 1.2.6 聚合酶蛋白15
• 1.3 禽副黏病毒研究現(xiàn)狀15-17
• 1.4 本研究的目的與意義17-18
• 第二章 禽2型副黏病毒的分離與鑒定18-23
• 2.1 材料與方法18-20
• 2.1.1 樣品來源18
• 2.1.2 雞胚18
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)中主要試劑18
• 2.1.4 病毒的分離18
• 2.1.5 電鏡負(fù)染色檢測(cè)18-19
• 2.1.6 隨機(jī)擴(kuò)增19
• 2.1.7 HI試驗(yàn)19-20
• 2.2 結(jié)果20-22
• 2.2.1 病毒的分離20
• 2.2.2 電鏡觀察20
• 2.2.3 核酸分析20-21
• 2.2.4 HI試驗(yàn)21-22
• 2.3 討論22-23
• 第三章 分離病毒的全基因組測(cè)定及分析23-39
• 3.1 材料與方法23-26
• 3.1.1 主要試劑23
• 3.1.2 引物設(shè)計(jì)23-24
• 3.1.3 病毒RNA的提取24
• 3.1.4 全基因組序列測(cè)定24-25
• 3.1.4.1 中間部分序列測(cè)定24
• 3.1.4.2 兩末端序列測(cè)定24-25
• 3.1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳25
• 3.1.5 序列拼接與分析25-26
• 3.2 結(jié)果26-38
• 3.2.1 全基因組拼接及分析26-31
• 3.2.2 N基因分析31
• 3.2.3 P基因分析31
• 3.2.4 M基因分析31
• 3.2.5 F基因分析31-32
• 3.2.6 HN基因分析32
• 3.2.7 L基因分析32-35
• 3.2.8 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建及分析35-38
• 3.2.8.1 F基因與HN基因進(jìn)化樹分析35-36
• 3.2.8.2 全基因組進(jìn)化樹分析36-38
• 3.3 討論38-39
• 第四章 分離病毒致病性初步研究39-44
• 4.1 材料與方法39-40
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料與主要試劑39
• 4.1.2 病毒致病指數(shù)測(cè)定39
• 4.1.2.1 雞胚平均致死時(shí)間39
• 4.1.2.2 腦內(nèi)接種致病指數(shù)39
• 4.1.3 SPF雞感染性試驗(yàn)39-40
• 4.1.4 BALB/c小鼠感染性試驗(yàn)40
• 4.1.5 組織和拭子中病毒分離檢測(cè)40
• 4.2 結(jié)果40-42
• 4.2.1 雞胚平均致死時(shí)間與腦內(nèi)接種致死時(shí)間40
• 4.2.2 SPF雞抗體水平檢測(cè)40-41
• 4.2.3 SPF雞組織中病毒分離檢測(cè)41
• 4.2.4 SPF雞氣管組織病理變化41-42
• 4.2.5 BALB/c小鼠組織中病毒分離檢測(cè)42
• 4.3 討論42-44
• 第5章 全文結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 致謝49-50
• 作者簡(jiǎn)歷50

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本文編號(hào)：776341