發(fā)布時(shí)間：2017-08-17 10:08

  本文關(guān)鍵詞：苧麻性別分化相關(guān)基因的克隆、表達(dá)及遺傳轉(zhuǎn)化研究

  更多相關(guān)文章： 苧麻 ACC氧化酶 ACC合成酶 表達(dá) 轉(zhuǎn)化

【摘要】：苧麻(Boehmeria nivea (L.) Gaud)是一種重要的多年生韌皮纖維作物,而苧麻開花不利于其營養(yǎng)生長,特別是三麻期會大量開花結(jié)實(shí),從而使纖維品質(zhì)和產(chǎn)量嚴(yán)重下降。另外,苧麻是雌雄同株,異花授粉作物,雜種優(yōu)勢利用潛力較大。但是由于苧麻品種高度雜合,F1代分離嚴(yán)重,需要在雜種優(yōu)勢利用中隔離和去雄,費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此生產(chǎn)中利用無花,或單一性別的苧麻具有重要意義。有研究發(fā)現(xiàn),苧麻花發(fā)育和性別分化與乙烯密切相關(guān),因此,研究苧麻性別分化相關(guān)基因,并對乙烯合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行克隆、表達(dá)特征分析和遺傳轉(zhuǎn)化,對進(jìn)一步了解苧麻性別決定分子機(jī)制和改良苧麻品種具有重要意義。本研究以苧麻GBN-08、GBN-09為材料,克隆了2個(gè)ACO基因和1個(gè)ACS基因的全長cDNA序列,進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,組織表達(dá)特異性分析,構(gòu)建了過表達(dá)載體,獲得了轉(zhuǎn)BnACO1擬南芥植物。具體主要研究成果如下：1、苧麻BnACO1, BnACO2, BnACS2基因的cDNA序列全長分別為1476 bp,1377bp,1680bp。開放閱讀框分別為981 bp,957bp,1503bp。編碼氨基酸分別為326個(gè),318個(gè),500個(gè)。經(jīng)Blast比對,BnACO.1基因與無花果等物種的ACO基因核苷酸序列相似性在79%以上,氨基酸序列的相似性在78%以上。苧麻BnAC02基因與桑白皮等物種ACO基因核苷酸序列相似性在82%以上,氨基酸序列相似性在84%以上。BnACS2基因與雜交種玫瑰等物種的ACS基因核苷酸序列的相似性在70%以上,氨基酸序列的相似性分別為65%以上。保守結(jié)構(gòu)域分析,BnACO1基因和BnACO2基因?qū)儆?0G-Fe Ⅱ_Oxy superfamily。BnACS2基因?qū)儆谝粤姿徇炼呷?PLP)為輔酶的天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶家族(AA_Ⅰ superfamily)。2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析表明苧麻BnACO1在苧麻根、莖、莖尖、葉片、雌花和雄花中均有表達(dá),其中,在雄花中表達(dá)最高,在根、莖中表達(dá)最低,且該基因受ABA、干旱和NaCl脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。該基因可能在苧麻性別分化中起到一定作用并且在調(diào)控苧麻生長發(fā)育和應(yīng)對環(huán)境脅迫時(shí)具有獨(dú)特的表達(dá)模式。BnACO1、 BnAC02、BnACS2三個(gè)基因在GBN-08、GBN-09的雌花發(fā)育初期均有表達(dá),特別在雌花花芽長度為2.0cm左右時(shí)表達(dá)差異性顯著。3、成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pQE-BnAC02,在37℃C條件下,1.0mmol/LIPTG誘導(dǎo)PQE-BnAC02表達(dá)出目的蛋白,誘導(dǎo)蛋白分子量大小約為36.15 kDa,與預(yù)測的蛋白大小一致。成功構(gòu)建了過表達(dá)載體pRI 101-BnACO2,農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化擬南芥初步獲得陽性轉(zhuǎn)基因植株,并收獲轉(zhuǎn)基因擬南芥種子。
【關(guān)鍵詞】：苧麻 ACC氧化酶 ACC合成酶 表達(dá) 轉(zhuǎn)化
【學(xué)位授予單位】：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S563.1
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 第1章 前言10-15
• 1.1 內(nèi)源乙烯對植物性別表達(dá)的研究進(jìn)展10-11
• 1.2 乙烯的生物合成11-14
• 1.2.1 ACC合成酶基因的克隆與功能研究進(jìn)展11-12
• 1.2.2 ACC合成酶基因的表達(dá)調(diào)控12-13
• 1.2.3 ACC氧化酶基因克隆的研究進(jìn)展13
• 1.2.4 ACC氧化酶基因的表達(dá)調(diào)控13-14
• 1.3 本研究的目的和意義14-15
• 第2章 苧麻ACO和ACS家族部分基因的克隆和序列分析15-34
• 2.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器15
• 2.2 方法15-23
• 2.2.1 苧麻組織總RNA的提取15-16
• 2.2.2 首鏈cDNA的合成16-19
• 2.2.3 RACE引物設(shè)計(jì)19-20
• 2.2.4 PCR擴(kuò)增及目的基因片段的純化回收20-22
• 2.2.5 PCR產(chǎn)物的TA克隆22
• 2.2.6 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T122
• 2.2.7 PCR篩選陽性克隆22-23
• 2.2.8 cDNA開放讀碼框序列擴(kuò)增23
• 2.2.9 克隆基因的生物信息學(xué)分析23
• 2.3 結(jié)果與分析23-32
• 2.3.1 BnACO1、BnACO2、BnACS2全長基因的克隆23-25
• 2.3.2 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的生物信息學(xué)分析25-32
• 2.4 討論32-34
• 第3章 苧麻ACO1,ACO2,ACS2基因的表達(dá)特征分析34-44
• 3.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器34
• 3.2 方法34-36
• 3.2.1 苧麻各組織總RNA的提取34-35
• 3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)35
• 3.2.3 gDNA去除和第一鏈cDNA的合成35-36
• 3.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR36
• 3.3 結(jié)果與分析36-41
• 3.3.1 RNA提取36-37
• 3.3.2 BnACO1基因不同部位表達(dá)差異性及脅迫誘導(dǎo)表達(dá)分析37-39
• 3.3.3 BnACO1、BnACO2、BnACS2基因的時(shí)空表達(dá)分析39-41
• 3.4 討論與分析41-44
• 第4章 BnACO2基因原核表達(dá)、過表達(dá)載體構(gòu)建以及及轉(zhuǎn)化擬南芥研究44-56
• 4.1 試驗(yàn)材料、試劑與儀器44
• 4.2 方法44-51
• 4.2.1 原核表達(dá)載體構(gòu)建44-48
• 4.2.2 植物轉(zhuǎn)基因過表達(dá)載體的構(gòu)建48-49
• 4.2.3 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌49-50
• 4.2.4 轉(zhuǎn)化擬南芥50
• 4.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和PCR鑒定50-51
• 4.3 結(jié)果與分析51-54
• 4.3.1 BnACO2基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證51-52
• 4.3.2 BnACO2基因過表達(dá)載體的構(gòu)建與重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證52-53
• 4.3.3 轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得53-54
• 4.3.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的PCR鑒定54
• 4.4 討論54-56
• 第5章 結(jié)論與展望56-58
• 5.1 論文結(jié)論56
• 5.2 后續(xù)研究56-58
• 參考文獻(xiàn)58-63
• 致謝63-64
• 作者簡介64

【相似文獻(xiàn)】

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本文編號：688410