本文關(guān)鍵詞：山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤microRNA的表達(dá)差異研究

  更多相關(guān)文章： miRNA 山羊地方性鼻內(nèi)腫癌 Illumina高通量測(cè)序 RT-PCR

【摘要】：山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤(enzootic nasal Tumor, ENT),又稱山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤,是由山羊地方性鼻內(nèi)腫瘤病毒(Enzootic Nasal Tumor Virus of Goats, ENTV-2)引起的一種慢性、進(jìn)行性、接觸性傳染病。該病發(fā)病率為5%-15%,至今沒有有效的措施進(jìn)行早期診斷,一旦出現(xiàn)臨床癥狀,幾乎都以死亡告終。ENTV體外培養(yǎng)體系的缺乏,使該病毒的致瘤機(jī)制和免疫特性研究遇到了阻礙。MicroRNA(miRNA)是一類非編碼RNA,長(zhǎng)度約為21-24nt。研究表明,miRNA在人類多個(gè)癌癥研究中發(fā)揮了重要的作用。本研究基于腫瘤與miRNA的密切關(guān)系,通過Illumina高通量測(cè)序及熒光定量PCR技術(shù),利用生物信息學(xué)軟件和NCBI等數(shù)據(jù)庫信息,發(fā)掘在山羊鼻腫瘤組織和癌旁組織中差異性表達(dá)的miRNA及其靶標(biāo)的功能和所涉及到的信號(hào)通路。利用生物信息學(xué)軟件,將測(cè)序所得的有效數(shù)據(jù)與Rfam以及EST等數(shù)據(jù)庫比對(duì)去除非miRNA,余下序列與山羊基因組比對(duì),獲得新miRNA,用RNAfold二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件識(shí)別新miRNA的成熟體和前體,利用miRDeep軟件結(jié)合近緣物種同源的miRNA序列,采用假陽性率對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果給予評(píng)價(jià)。采用TPM計(jì)算度量指標(biāo)計(jì)算所獲得的miRNA在腫瘤組和對(duì)照組中的表達(dá)量,利用DESeq軟件篩選出腫瘤組相對(duì)于對(duì)照組滿足p0.05和大于等于2倍差異表達(dá)范圍的差異miRNA 。利用miranda算法從miRNA-3'UTR序列匹配得分和能量穩(wěn)定性評(píng)估,使用閾值參數(shù)：Scores≥150,△G-30 kcal/mol和嚴(yán)格的種子區(qū)域配對(duì),預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。用Gene ontology、KEGG pathway分析軟件結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫的信息,對(duì)滿足條件的差異性表達(dá)miRNA的靶標(biāo)進(jìn)行功能注釋和分類,并找出靶標(biāo)所參與的信號(hào)通路,致力于揭示miRNA在腫瘤形成中的作用。應(yīng)用熒光定量PCR,根據(jù)測(cè)序所得序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)7個(gè)已知miRNA和2個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA進(jìn)行了驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：406條為已知miRNA,29條為新發(fā)現(xiàn)miRNA,其中只在腫瘤組或?qū)φ战M表達(dá)的有34條(包含3條新]miRNA);腫瘤組相對(duì)于對(duì)照組有116條miRNA有顯著表達(dá)差異,其中54條在腫瘤組中下調(diào),60條在腫瘤組織上調(diào),有2條只在對(duì)照組中表達(dá)。另外,在功能分析中,預(yù)測(cè)出顯著差異表達(dá)121 miRNA(116條顯著差異表達(dá)的miRNA和5條star序列)的非沉余靶標(biāo)共6925個(gè)以及1792條顯著富集GO和97條顯著富集KEGG pathway。 GO和KEGG pathway功能分析顯示所占比例最大的6個(gè)通路分別為MAPK signaling pathway、Ras signaling pathway、prolactin signaling pathway、 Pathways in cancer、Viral carcinogenesis和MicroRNA in cancer,部分基因涉及到細(xì)胞分化、凋亡,代謝等重要生命過程,我們預(yù)測(cè)chi-mir-133a、chi-mir-145-5p、mchi-mir-146a/200a可能作用于靶基因BRAF而通過對(duì)MAPK信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路,影響了細(xì)胞的正常分裂周期,促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,對(duì)ENA的形成起到了促進(jìn)作用。預(yù)測(cè)chi-mir-874-3p作用于靶標(biāo)VEGFA、chi-mir-148a-3p作用于靶標(biāo) TGFβRAP1,可能使得腫瘤細(xì)胞逃脫了TGFβ的抑制生長(zhǎng)作用,對(duì)ENA的發(fā)生、發(fā)展創(chuàng)造了條件；而低表達(dá)的金屬蛋白酶和Syndecan在ENA的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了抑制作用。經(jīng)過熒光定量PCR的驗(yàn)證得出：被檢測(cè)的9條miRNAs中,所有候選miRNA的表達(dá)趨勢(shì)同高通量測(cè)序結(jié)果一致,其中chi-miR-218在測(cè)序和qPCR驗(yàn)證中都表現(xiàn)出了在腫瘤組下調(diào),但下調(diào)的倍數(shù)有所差異,而2條新miRNA的成功擴(kuò)增,顯示它們確實(shí)是存在于組織中的,也暗示了本次測(cè)序的可靠性。本研究首次對(duì)山羊ENA中miRNA進(jìn)行大規(guī)模鑒定,為闡明復(fù)雜而精確的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和ENA的發(fā)展過程提供參考。
【關(guān)鍵詞】：miRNA 山羊地方性鼻內(nèi)腫癌 Illumina高通量測(cè)序 RT-PCR
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S858.27
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 符號(hào)說明9-13
• 1. 文獻(xiàn)綜述13-24
• 1.1 山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤14
• 1.2 MIRNA的生物合成與在腫瘤中的功能14-16
• 1.3 MIRNA與腫瘤16-20
• 1.3.1 乳腺腫瘤與miRNA16-18
• 1.3.2 人類肺癌中代表性miRNA18-19
• 1.3.3 人類鼻咽癌與miRNA19-20
• 1.4 MIRNA的預(yù)測(cè)與鑒定20-24
• 1.4.1 miRNA微陣列芯片與實(shí)時(shí)PCR連用檢測(cè)已知miRNA的表達(dá)差異20-21
• 1.4.2 直接克隆法和生物信息學(xué)相結(jié)合尋找新miRNA21-22
• 1.4.3 構(gòu)建重組載體與Western blot聯(lián)用檢測(cè)特定miRNA對(duì)某腫瘤相應(yīng)基因表達(dá)蛋白的影響22-23
• 1.4.4 第二代高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)相結(jié)合尋找新miRNA23-24
• 1.5 研究的目的意義24
• 2. 材料與方法24-39
• 2.1 材料24-27
• 2.1.1 組織材料、菌株24
• 2.1.2 主要試劑和溶液配制24-25
• 2.1.3 主要儀器設(shè)備25-26
• 2.1.4 使用的數(shù)據(jù)庫及分析軟件26-27
• 2.2 方法27-39
• 2.2.1 總RNA的抽提27-28
• 2.2.2 Illumina深度測(cè)序的試驗(yàn)流程28-29
• 2.2.3 Illumina深度測(cè)序的生物信息分析29-33
• 2.2.4 PCR引物33-34
• 2.2.5 候選miRNA的真實(shí)性檢測(cè)34-38
• 2.2.6 候選miRNA表達(dá)譜的qPCR驗(yàn)證38-39
• 3. 結(jié)果39-55
• 3.1 山羊ENA腫瘤組織小分子RNA的深度測(cè)序39-51
• 3.1.1 總RNA的提取結(jié)果39
• 3.1.2 小分子RNA的序列信息39-42
• 3.1.3 小分子RNA序列的分類注釋42-43
• 3.1.4 山羊鼻組織中已知miRNA分析43-50
• 3.1.5 山羊鼻組織中新發(fā)現(xiàn)的miRNA分析50-51
• 3.2 部分候選MIRNA的PCR分析51-55
• 3.2.1 部分候選miRNA的普通PCR分析51-53
• 3.2.2 部分候選miRNA的熒光定量PCR分析53-55
• 4. 討論55-61
• 4.1 ILLUMINA HISEQ測(cè)序的優(yōu)勢(shì)與不足55-56
• 4.2 ILLUMINA HISEQ測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量的可靠性56-57
• 4.3 MIRNA的靶基因預(yù)測(cè)57-58
• 4.4 部分重要MIRNA靶基因的作用方式58-61
• 5. 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-69
• 致謝69-70
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄70

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