本文關(guān)鍵詞：抗無乳鏈球菌中藥的篩選及鹽酸小檗堿抗無乳鏈球菌作用機(jī)理的初步研究

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【摘要】：無乳鏈球菌是奶牛乳房炎的致病菌之一,患有乳房炎的奶牛會(huì)影響牛奶的產(chǎn)量和品質(zhì),目前奶牛乳房炎的主要治療手段是使用抗生素療法,但抗生素易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性,影響治療效果。中草藥具有不易產(chǎn)生耐藥性、高效低毒、低殘留的優(yōu)勢(shì)。因此本研究對(duì)20味中藥的有效成分進(jìn)行提取,篩選出抗無乳鏈球菌最優(yōu)的中藥,對(duì)其單味中藥進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化,在最佳提取工藝條件下,研究黃連提取物對(duì)引致奶牛乳房炎的主要致病菌的體外抑菌活性,然后以抑菌效果最優(yōu)的中藥有效成分的單體物質(zhì)為研究對(duì)象,進(jìn)行抗無乳鏈球菌的抑菌機(jī)理的初步研究。主要研究內(nèi)容如下：1抗無乳鏈球菌中藥的篩選：采用乙醇回流法和超聲波法提取20味中藥的有效成分,測(cè)定黃連等20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration, MBC)。20味中藥提取物的體外抗菌活性結(jié)果表明：黃連、虎杖、地榆和黃芩4味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為78mg/mL～15.625mg/mL;蒲公英、烏梅、茵陳、秦皮、艾葉和紫花地丁6味中藥提取物的MIC值范圍為3125mg/mL～62.5mg/mL, MBC值范圍為62.5mg/mL～125mg/mL;黃柏、魚腥草和白頭翁3味中藥提取物的MIC值和MBC值均為125mg/mL;苦參、金銀花、穿心蓮、杜仲、連翹、夏枯草和何首烏7味中藥提取物的MIC值和MBC值范圍為25 0mg/mL～500mg/mL。結(jié)論：篩選出黃連提取物對(duì)無乳鏈球菌具有最好的體外抑菌效果。2黃連抗無乳鏈球菌的最優(yōu)提取工藝及體外抑菌活性研究：采用正交設(shè)計(jì),以浸膏得率及對(duì)無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)值和最低殺菌濃度(MBC)為指標(biāo),對(duì)黃連提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)選研究,在黃連的最佳提取工藝條件下,測(cè)定黃連提取物對(duì)奶牛乳房炎的主要致病菌即無乳鏈球菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值。最佳提取工藝結(jié)果表明,黃連的最佳提取工藝為料液比1：8,80%乙醇濃度回流提取2次,每次1.5h。黃連體外抑菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黃連提取物對(duì)無乳鏈球菌的MIC值和MBC值均為39mg/mL,對(duì)大腸桿菌的MIC值和MBC值分別為62.5mg/mL和125mg/mL,對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值和MBC值均為3125mg/mL。結(jié)論：在最佳提取工藝下的黃連提取物抑菌效果提高,且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用。3鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)及乳酸脫氫酶活性的影響：利用平板稀釋法繪制出鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的抑菌曲線,通過透射電子顯微鏡觀察鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌超微結(jié)構(gòu)的影響,測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)活力研究鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌酶活性的影響。抑菌曲線結(jié)果表明,在MIC濃度下,鹽酸小檗堿能夠抑制細(xì)菌的生長；在2MIC濃度下,鹽酸小檗堿能在4h內(nèi)將細(xì)菌全部殺死。透射電鏡結(jié)果表明,正常組無乳鏈球菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰完整,從內(nèi)到外可見層次分明的核區(qū),細(xì)胞膜和細(xì)胞壁。在鹽酸小檗堿的作用下,細(xì)胞形狀變得不規(guī)則,細(xì)胞膜、細(xì)胞壁逐漸溶解,膜壁界限變得模糊,細(xì)胞質(zhì)嚴(yán)重外流,核區(qū)不清晰,細(xì)胞質(zhì)解體內(nèi)出現(xiàn)空腔。測(cè)定酶活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)過藥物作用后,乳酸脫氫酶活力下降。結(jié)論：鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的抑菌曲線呈現(xiàn)了濃度時(shí)間的相關(guān)性。鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的結(jié)構(gòu)有較強(qiáng)的破壞作用,隨著時(shí)間的延長破壞加劇,且可以降低乳酸脫氫酶的活性。4鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響：通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)實(shí)驗(yàn)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)核酸熒光染色法研究鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響。SDS-PAGE結(jié)果表明,正常無乳鏈球菌蛋白譜帶多且清晰,而經(jīng)藥物作用后,蛋白譜帶變淺,有的譜帶甚至消失；DAPI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,正常無乳鏈球菌DNA熒光強(qiáng)度較強(qiáng),且熒光點(diǎn)較多,經(jīng)過藥物作用后DNA熒光強(qiáng)度明顯減弱。結(jié)論：鹽酸小檗堿可以影響蛋白質(zhì)和DNA的合成。
【關(guān)鍵詞】：無乳鏈球菌 鹽酸小檗堿 抑菌活性 抑菌機(jī)理
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S853.7
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-9
• 縮略詞表9-14
• 第一章 文獻(xiàn)綜述及研究目的意義14-24
• 1 文獻(xiàn)綜述14-23
• 1.1 無乳鏈球菌研究概況14-15
• 1.1.1 無乳鏈球菌的病原學(xué)和流行病學(xué)14
• 1.1.2 無乳鏈球菌的致病危害及致病機(jī)理14-15
• 1.1.3 奶牛乳房炎的臨床癥狀及病理變化15
• 1.2 奶牛乳房炎的防治現(xiàn)狀15-17
• 1.2.1 抗菌藥物治療15
• 1.2.2 中草藥治療15-16
• 1.2.3 抗生素和中草藥結(jié)合治療16
• 1.2.4 生物制劑治療16-17
• 1.3 天然藥物抗菌研究進(jìn)展17-18
• 1.4 天然藥物中抗菌有效成分的研究進(jìn)展18-19
• 1.5 天然藥物抗菌機(jī)理的研究進(jìn)展19-21
• 1.5.1 干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成和細(xì)胞膜的通透性19
• 1.5.2 影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成19-20
• 1.5.3 干擾微生物的酶系,破壞其正常的新陳代謝,抑制酶的活性20
• 1.5.4 對(duì)細(xì)菌呼吸代謝的抑制20
• 1.5.5 對(duì)細(xì)菌生長曲線的影響20-21
• 1.5.6 對(duì)細(xì)菌DNA、RNA含量的影響21
• 1.6 黃連及鹽酸小檗堿研究進(jìn)展21-23
• 1.6.1 抗腫瘤作用21-22
• 1.6.2 降血脂作用22
• 1.6.3 降血糖作用22
• 1.6.4 抗微生物作用22-23
• 2 研究目的與意義23-24
• 第二章 抗無乳鏈球菌中藥的篩選24-31
• 1 材料與方法24-28
• 1.1 材料24-25
• 1.1.1 菌株24
• 1.1.2 藥材24
• 1.1.3 培養(yǎng)基及試劑24-25
• 1.1.4 主要儀器設(shè)備25
• 1.2 方法25-28
• 1.2.1 中藥的提取25-27
• 1.2.2 細(xì)菌菌懸液的制備27
• 1.2.3 20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)27-28
• 2 結(jié)果與分析28-29
• 2.1 20味中藥提取物對(duì)無乳鏈球菌的體外抑菌活性研究28-29
• 3 討論29-31
• 第三章 黃連抗無乳鏈球菌的最優(yōu)提取工藝及體外抑菌活性研究31-38
• 1 材料與方法31-34
• 1.1 材料31-32
• 1.1.1 菌種31
• 1.1.2 儀器設(shè)備與試劑31-32
• 1.1.3 培養(yǎng)基32
• 1.2 方法32-34
• 1.2.1 黃連提取工藝的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)32-33
• 1.2.2 正交試驗(yàn)黃連的體外抑菌活性33
• 1.2.3 黃連最佳提取工芝下的體外抑菌活性33-34
• 2 結(jié)果與分析34-36
• 2.1 黃連最佳提取工藝的優(yōu)選34-35
• 2.2 最佳提取工藝下黃連對(duì)3種細(xì)菌的體外抑菌活性研究35-36
• 3 討論36-38
• 第四章 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌形態(tài)結(jié)構(gòu)及乳酸脫氫酶活性的影響38-45
• 1 材料與方法38-40
• 1.1 材料38-39
• 1.1.1 菌種及培養(yǎng)基38
• 1.1.2 藥物38
• 1.1.3 主要儀器38-39
• 1.1.4 試劑39
• 1.2 方法39-40
• 1.2.1 鹽酸小檗堿藥物的制備39
• 1.2.2 菌懸液的制備39
• 1.2.3 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的MIC39
• 1.2.4 抑菌曲線的繪制39-40
• 1.2.5 透射電鏡樣品的制備及觀察40
• 1.2.6 測(cè)定無乳鏈球菌LDH40
• 2 結(jié)果與分析40-42
• 2.1 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的MIC40
• 2.2 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌的抑菌曲線40-41
• 2.3 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌超微結(jié)構(gòu)的影響41
• 2.4 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌LDH的影響41-42
• 3 討論42-45
• 第五章 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌蛋白質(zhì)和DNA的影響45-50
• 1 材料與方法45-46
• 1.1 材料45-46
• 1.1.1 菌種及培養(yǎng)基45
• 1.1.2 藥物及試劑45
• 1.1.3 主要儀器設(shè)備45-46
• 1.2 方法46
• 1.2.1 鹽酸小檗堿藥液的制備46
• 1.2.2 菌懸液的制備46
• 1.2.3 SDS-聚丙酰胺凝膠電泳46
• 1.2.4 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌DNA熒光強(qiáng)度變化的影響46
• 2 結(jié)果與分析46-48
• 2.1 SDS-聚丙酰胺凝膠電泳結(jié)果46-47
• 2.2 鹽酸小檗堿對(duì)無乳鏈球菌DNA熒光強(qiáng)度變化的影響47-48
• 3 討論48-50
• 第六章 結(jié)論與創(chuàng)新50-52
• 1 結(jié)論50
• 2 創(chuàng)新50-52
• 參考文獻(xiàn)52-61
• 致謝61-62
• 附圖62-65
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文65

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10 祝t熈，

本文編號(hào)：578750