本文關(guān)鍵詞：青稞查爾酮異構(gòu)酶基因的克隆及原核表達分析

  更多相關(guān)文章： 大麥 青稞 查爾酮異構(gòu)酶基因 克隆 原核表達

【摘要】：青稞(Qingike, Hordeum vulgare L. var. nudum Hook. F)也稱裸大麥,其籽粒富含黃酮等營養(yǎng)功能成分,具有較高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用,已越來越受大麥研究者的青睞。黃酮類化合物是一類在自然界廣泛分布的多酚類次生代謝物質(zhì),是色原烷或色原酮的衍生物,在植物自身生理活動中起著重要的作用,參與紫外線防護、花色形成、調(diào)節(jié)生長、抗病原微生物、誘導植物與微生物相互作用等,與人類的健康有密切的聯(lián)系,具有清除自由基、保護心腦血管、抗腫瘤、抗氧化和抗炎癥等多種藥用價值。類黃酮代謝是植物中重要的次生代謝途徑之一,是植物黃酮合成的重要方式。查爾酮異構(gòu)酶(chalcone isomerase,CHI,EC5.5.1.6)是第一個被認識的黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)酶,也是類黃酮代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶,催化分子內(nèi)環(huán)化反應(yīng)將雙環(huán)的查爾酮轉(zhuǎn)化為有生物學活性的三環(huán)二羥基黃烷酮,對黃酮類物質(zhì)的合成具有重要作用。本研究以實驗室篩選的高黃酮青稞品種“94-19-1”為材料,通過同源克隆獲得青稞查爾酮異構(gòu)酶基因HvCHI的編碼序列CDS(Coding sequence)全長,對序列進行了生物信息學分析和進化樹分析,構(gòu)建原核表達載體并進行了原核表達初步研究,為深入研究CHI基因在青稞類黃酮代謝中的分子調(diào)控機制提供依據(jù),對青稞高黃酮含量的育種具有指導價值。主要結(jié)果如下：1.根據(jù)GenBank中已登錄的大麥CHI基因的CDS區(qū)序列設(shè)計引物,通過同源克隆及測序成功得到青稞CHI基因的CDS區(qū)全序列,CDS區(qū)全長696 bp,編碼231個氨基酸。酶蛋白分子量為23.68 KDa,預測等電點(PI)為5.22,為酸性蛋白。酶蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為23.96,屬于穩(wěn)定蛋白。其所有氨基酸組成中Ala最多,Cys、Gln和Trp最少。平均親水指數(shù)為0.299,屬于親水性蛋白。存在5個絲氨酸和1個酪氨酸磷酸化活性位點。信號肽預測結(jié)果顯示,該蛋白無信號肽。預測該酶蛋白為非分泌性蛋白。二硫鍵預測軟件分析表明,在Cys113和Cys183一個區(qū)域可能存在二硫鍵。2.對包括青稞在內(nèi)的14種植物的CHI基因序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)進化樹表明：該進化樹分為2個亞群：單子葉植物(Ⅱ)和雙子葉植物(Ⅰ)。其中Ⅰ類包含了矮牽牛、葡萄、百脈根、金蕎麥、苜宿、菜豆等植物；Ⅱ類包括普通小麥、玉米、大麥和節(jié)節(jié)麥等植物。青稞CHI基因與同為單子葉的大麥、節(jié)節(jié)麥等的同源性最高,與雙子葉植物的橙子、矮牽牛同源性最低。3.將青稞CHI基因的編碼序列與表達載體pET-32a相連后,pET-32a-HvCHI在大腸桿菌BL21中進行原核表達, HvCHI基因編碼的蛋白與pET-32a表達載體上的標簽蛋白形成44 KDa左右的融合蛋白,與預測結(jié)果一致。本試驗原核表達的誘導濃度為0.5 mM,第4 h的融合蛋白量最大,并對融合蛋白進行了初步純化。
【關(guān)鍵詞】：大麥 青稞 查爾酮異構(gòu)酶基因 克隆 原核表達
【學位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S512.3;Q943.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 主要縮略符號對照表8-12
• 1 文獻綜述12-22
• 1.1 青稞概述12
• 1.2 黃酮概述12-17
• 1.2.1 植物自身生理功能15
• 1.2.2 清除自由基及抗氧化作用15-16
• 1.2.3 抗癌抗腫瘤的作用16
• 1.2.4 抗抑郁作用16-17
• 1.2.5 其他功能17
• 1.3 CHI基因概述17-21
• 1.3.1 CHI基因的發(fā)現(xiàn)18-19
• 1.3.2 CHI基因的結(jié)構(gòu)與類型19-20
• 1.3.3 CHI基因的表達調(diào)控20
• 1.3.4 CHI基因的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用20-21
• 1.4 目的與意義21-22
• 2 材料和方法22-38
• 2.1 實驗材料22-24
• 2.1.1 實驗植物材料22
• 2.1.2 實驗主要儀器和試劑22
• 2.1.3 實驗菌株和載體22-23
• 2.1.4 實驗試劑溶液的配制23-24
• 2.2 青稞CHI基因CDS區(qū)的克隆24-29
• 2.2.1 總RNA提取24-25
• 2.2.2 反轉(zhuǎn)錄：cDNA第一鏈的合成25-26
• 2.2.3 引物設(shè)計26
• 2.2.4 PCR擴增26-27
• 2.2.5 目的片段回收和純化27-28
• 2.2.6 目的片段與載體的連接28-29
• 2.2.7 陽性克隆鑒定及測序29
• 2.3 生物信息學分析29-31
• 2.3.1 HvCHI蛋白的理化性質(zhì)與等電點預測29
• 2.3.2 HvCHI蛋白的親水性預測29-30
• 2.3.3 HvCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測30
• 2.3.4 HvCHI基因CDS區(qū)密碼子的偏倚性分析30
• 2.3.5 HvCHI蛋白的跨膜預測30
• 2.3.6 HvCHI蛋白的糖基化位點及磷酸化位點預測30
• 2.3.7 HvCHI蛋白的信號肽預測30-31
• 2.3.8 HvCHI蛋白的二硫鍵、亞細胞定位及稀有密碼子預測31
• 2.3.9 HvCHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)31
• 2.4 HvCHI基因的原核表達31-38
• 2.4.1 酶切引物的設(shè)計31
• 2.4.2 PCR擴增及回收31-32
• 2.4.3 HvCHI基因與T載體的連接32
• 2.4.4 HvCHI基因的轉(zhuǎn)化與鑒定32
• 2.4.5 構(gòu)建原核表達載體32-35
• 2.4.6 重組蛋白的表達35-36
• 2.4.7 SDS-PAGE電泳36-37
• 2.4.8 融合蛋白初步純化37-38
• 3 結(jié)果與分析38-57
• 3.1 RNA的檢測38
• 3.2 HvCHI基因的PCR擴增38-40
• 3.3 HvCHI基因的原核表達40-42
• 3.4 SDS-PAGE分析42-44
• 3.5 生物信息學分析44-57
• 3.5.1 核苷酸序列分析44-45
• 3.5.2 序列分析及進化樹的構(gòu)建45-48
• 3.5.3 HvCHI蛋白的理化性質(zhì)分析與等電點預測48-49
• 3.5.4 HvCHI蛋白的親水性預測49-50
• 3.5.5 HvCHI蛋白的二級結(jié)構(gòu)預測50-51
• 3.5.6 HvCHI基因CDS區(qū)密碼子的偏倚性分析51
• 3.5.7 HvCHI蛋白的跨膜預測51-52
• 3.5.8 HvCHI蛋白的糖基化及磷酸化位點預測52-53
• 3.5.9 信號肽預測53-54
• 3.5.10 二硫鍵、亞細胞定位及稀有密碼子預測54-55
• 3.5.11 結(jié)構(gòu)域預測55
• 3.5.12 HvCHI蛋白的三級結(jié)構(gòu)55-57
• 4 討論57-60
• 5 結(jié)論60-61
• 參考文獻61-70
• 致謝70-71
• 攻讀碩士期間發(fā)表的論文71

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2 高小磊;六種結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的原核表達及16 KD-38 KD和Ag85A血清學診斷效果的研究[D];蘭州大學;2015年

3 彭傳林;家蠅抗真菌肽MAF-1原核表達體系優(yōu)化與活性分析[D];貴陽醫(yī)學院;2015年

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10 姜旭;百合無癥病毒16kDα基因的克隆、原核表達及亞細胞定位[D];大連理工大學;2015年

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