本文關鍵詞：嶗山奶山羊乳腺上皮細胞轉染褪黑素合成酶基因的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：褪黑素(Melatonin,MT)是吲哚神經內分泌激素,具有調節(jié)生物鐘、直接清除體內自由基、抗氧化和調節(jié)免疫功能等功效。通過乳腺反應器來生產褪黑素具有研究意義和商業(yè)前景。嶗山奶山羊是我國特有的山羊品種,具有優(yōu)良的產奶性能,是乳腺反應器的良好模型。本研究針對褪黑素關鍵合成酶AANAT和HIOMT基因乳腺特異性表達載體轉染山羊乳腺上皮細胞的操作進行了系統(tǒng)的研究。本研究通過活體采集嶗山奶山羊的乳腺組織,利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細胞,純化后分別轉染AANAT和HIOMT基因,檢測這兩個外源基因在細胞中的表達水平和合成褪黑素的水平,以驗證是否可以作為轉基因的供體細胞。(1)采取綿羊松果體細胞中克隆出AANAT和HIOMT基因,使用Xho l酶切并連接,構建載體pBC1-AANAT和pBC1-HIOMTo再由質粒pcDNA3.1-myc-his中擴增純化得到上下游均添加了Not I酶切位點的Neo片段,通過對Neo擴增片段及質粒pBC 1-AANAT/pBC 1-HIOMT進行Not I單酶切后,連接片段構建能夠在真核細胞進行抗性篩選的重組質粒pBC 1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo。菌液PCR和酶切驗證,結果表明呈陽性,檢測序列正確。(2)采集泌乳期健康嶗山奶山羊乳腺組織,進行組織塊貼壁培養(yǎng)法分離得到兩組山羊乳腺上皮細胞,利用相差消化法進行乳腺上皮細胞的分離純化。結果顯示得到純凈的乳腺上皮細胞。細胞呈鵝卵石樣,排列緊密,高倍顯微鏡下觀察可見多核,呈典型上皮細胞特征。細胞生長曲線類似與“S”形,符合細胞生長的生物學規(guī)律。(3)使用脂質體2000將真核表達載體pBC1-AANAT-Neo, pBC1-HIOMT-Neo分別轉染到嶗山奶山羊乳腺上皮細胞中,建立了乳腺上皮細胞的兩種合成酶過表達系統(tǒng)。通過檢測轉基因細胞中AANAT和HIOMT的mRNA相對表達水平,驗證表達載體是否轉染成功。使用添加褪黑素合成前體五羥色胺(5-HT)的誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)轉基因細胞24 h后,檢測培養(yǎng)液中褪黑素含量。結果顯示：轉染AANAT和HIOMT的乳腺上皮細胞中都高表達了相應的基因,其合成酶AANAT和HIOMT的mRNA相對表達量均顯著高于對照組(p0.01)；轉染AANAT的乳腺上皮細胞誘導培養(yǎng)液中加入五羥色胺(5-HT),培養(yǎng)液中MT濃度顯著高于對照組(p0.01)。表明此轉染體系能夠成功獲得轉AANAT及HIOMT的嶗山奶山羊乳腺上皮細胞,并在存在褪黑素合成前體5-HT的情況下,合成顯著高于對照組的褪黑素量(45.31±2.32 ng/mL vs. 36.14±1.82ng/mL, p0.05)。綜上所述,本研究中的重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo、嶗山奶山羊乳腺上皮細胞及轉染體系均能用于乳腺反應器的上游實驗。
【關鍵詞】：嶗山奶山羊 乳腺上皮細胞 AANAT HIOMT 褪黑素 轉基因
【學位授予單位】：四川農業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 縮略詞表9-13
• 1 文獻綜述13-25
• 1.1 乳腺上皮細胞研究史簡述13-19
• 1.1.1 乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)13-14
• 1.1.2 乳腺上皮細胞的純化14
• 1.1.3 乳腺反應器的研究進展14-15
• 1.1.4 褪黑素及其生理功能15-18
• 1.1.5 嶗山奶山羊簡介18
• 1.1.6 褪黑素功能乳的發(fā)展現(xiàn)狀與前景18-19
• 1.2 轉基因動物技術的研究與應用19-25
• 1.2.1 轉基因動物的研究19-22
• 1.2.2 轉基因動物的應用22-23
• 1.2.3 轉基因動物的安全性23
• 1.2.4 研究目的與意義23-25
• 2 材料與方法25-44
• 2.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和載體構建的材料與方法25-35
• 2.1.1 松果體及質粒來源25
• 2.1.2 主要試劑25-26
• 2.1.3 主要儀器與耗材26
• 2.1.4 實驗設計26
• 2.1.5 松果體總RNA的提取26-27
• 2.1.6 RNA反轉錄27-28
• 2.1.7 AANAT、HIOMT基因片段擴增28-29
• 2.1.8 目的片段連接轉化至pMD~(TM)19-T載體29-30
• 2.1.9 陽性克隆pMD~(TM)19-T-AANAT及pMD~(TM)19-T-HIOMT質粒提取及檢測30
• 2.1.10 構建表達載體pBC1-AANAT與pBC1-HIOMT30-31
• 2.1.11 質粒pBC1-AANAT/HIOMT及質粒pcDNA3.1-myc-his的純化31
• 2.1.12 質粒pcDNA3.1-myc-his Neo元件模板擴增及回收31-33
• 2.1.13 Neo元件模板PCR產物和載體酶切,連接33-34
• 2.1.14 連接產物轉化Top 10化學感受態(tài)細胞34
• 2.1.15 重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鑒定34-35
• 2.1.16 重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鑒定35
• 2.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)的材料與方法35-39
• 2.2.1 組織來源35
• 2.2.2 主要試劑35-36
• 2.2.3 主要儀器與耗材36-37
• 2.2.4 乳腺組織的取材37
• 2.2.5 乳腺上皮細胞純化37-38
• 2.2.6 乳腺上皮細胞傳代培養(yǎng)38
• 2.2.7 乳腺上皮細胞的凍存和解凍培養(yǎng)38
• 2.2.8 乳腺上皮細胞生長曲線測定38-39
• 2.3 轉褪黑素合成酶基因乳腺上皮細胞功能驗證的材料與方法39-44
• 2.3.1 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞株和菌株來源39
• 2.3.2 主要試劑39
• 2.3.3 主要儀器與耗材39
• 2.3.4 重組質粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP的純化39-40
• 2.3.5 重組質粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP濃度測定40
• 2.3.6 脂質體介導的外源基因轉染山羊乳腺上皮細胞40
• 2.3.7 細胞總RNA的提取40-41
• 2.3.8 RNA反轉錄41-42
• 2.3.9 Real Time PCR42-43
• 2.3.10 數(shù)據統(tǒng)計分析43
• 2.3.11 細胞培養(yǎng)液中褪黑素濃度測定43
• 2.3.12 實驗設計43-44
• 3 結果與分析44-57
• 3.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和載體構建結果44-51
• 3.1.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆結果44-45
• 3.1.2 重組質粒pBC1-AANAT與pBC1-HIOMT測序結果45-48
• 3.1.3 Neo元件模板擴增結果48
• 3.1.4 重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鑒定48-49
• 3.1.5 重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鑒定49-50
• 3.1.6 重組質粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo圖譜50-51
• 3.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞培養(yǎng)的結果51-53
• 3.2.1 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞的生長特性51-53
• 3.2.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞生長曲線53
• 3.3 轉褪黑素合成酶基因乳腺上皮細胞功能驗證的結果53-57
• 3.3.1 重組質粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP的純化53-54
• 3.3.2 空載體pIRES2-EGFP轉染嶗山奶山羊乳腺上皮細胞驗證54
• 3.3.3 轉基因AANAT、HIOMT在嶗山奶山羊乳腺上皮細胞中的表達54-56
• 3.3.4 轉基因嶗山奶山羊乳腺上皮細胞合成褪黑素檢測56-57
• 4 討論57-61
• 4.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆57
• 4.2 載體pBC1-AANAT-NEO和PBC1-HIOMT-NEO的乳腺特異性表達57-58
• 4.3 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞的培養(yǎng)58-59
• 4.4 嶗山奶山羊乳腺上皮細胞轉染特異性表達載體PBC1-AANAT和PBC1-HIOMT59-61
• 5 結論61-62
• 參考文獻62-71
• 致謝71-72

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據庫 前10條

1 王作洲,韓文興;嶗山奶山羊[J];農家參謀;2004年06期

2 ;我國著名的地方良種——嶗山奶山羊[J];農業(yè)新技術;2004年05期

3 韓文興;王作洲;;我國著名的地方良種——嶗山奶山羊[J];中國農業(yè)文摘(畜牧);2004年02期

4 王建華;戈新;汪文鑫;程明;盧德勛;;磷在嶗山奶山羊體內消化、分配和利用的研究[J];飼料研究;2007年12期

5 ;嶗山奶山羊[J];中國畜禽種業(yè);2008年11期

6 趙金山;史淑艷;戴正浩;汪文鑫;;嶗山奶山羊發(fā)展現(xiàn)狀與產業(yè)化前景展望[J];山東畜牧獸醫(yī);2008年10期

7 周衍平，陳會英;嶗山奶山羊選育及利用技術研究的經濟效益評價[J];農業(yè)技術經濟;1994年03期

8 ;嶗山奶山羊[J];農業(yè)知識;2007年12期

9 戴正浩;董鵬;;提高嶗山奶山羊產奶量的幾點做法[J];科技致富向導;2011年10期

10 韓文興;王作洲;;嶗山奶山羊[J];農業(yè)知識;2003年11期

中國重要會議論文全文數(shù)據庫 前1條

1 馬曉麗;程明;劉開東;賀建寧;劉積鳳;柳楠;;GnRHR基因多態(tài)性與嶗山奶山羊產羔數(shù)的關聯(lián)分析[A];中國畜牧獸醫(yī)學會養(yǎng)羊學分會2014年全國養(yǎng)羊生產與學術研討會議論文集[C];2014年

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前2條

1 本報記者 張在杰　李戰(zhàn)彪;產學研結合助力嶗山奶山羊保種[N];山東科技報;2011年

2 袁峰;嶗山奶山羊啥時能出山[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2012年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前5條

1 宋怡樂;嶗山奶山羊乳腺上皮細胞轉染褪黑素合成酶基因的研究[D];四川農業(yè)大學;2015年

2 劉暢;嶗山奶山羊不同泌乳期乳的理化性質及熱穩(wěn)定性的研究[D];齊魯工業(yè)大學;2014年

3 李成渤;嶗山奶山羊微衛(wèi)星標記和DGAT1基因與泌乳性狀的關系[D];山東農業(yè)大學;2009年

4 劉園峰;嶗山奶山羊LEP、STAT5a基因多態(tài)性及與泌乳性狀和體尺性狀的關聯(lián)分析[D];山東農業(yè)大學;2013年

5 王金鳳;嶗山奶山羊ACACA和SCD基因多態(tài)性與泌乳性狀的關聯(lián)分析[D];山東農業(yè)大學;2011年

  本文關鍵詞：嶗山奶山羊乳腺上皮細胞轉染褪黑素合成酶基因的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：471299