本文關(guān)鍵詞：嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染褪黑素合成酶基因的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：褪黑素(Melatonin,MT)是吲哚神經(jīng)內(nèi)分泌激素,具有調(diào)節(jié)生物鐘、直接清除體內(nèi)自由基、抗氧化和調(diào)節(jié)免疫功能等功效。通過乳腺反應(yīng)器來生產(chǎn)褪黑素具有研究意義和商業(yè)前景。嶗山奶山羊是我國特有的山羊品種,具有優(yōu)良的產(chǎn)奶性能,是乳腺反應(yīng)器的良好模型。本研究針對褪黑素關(guān)鍵合成酶AANAT和HIOMT基因乳腺特異性表達(dá)載體轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞的操作進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。本研究通過活體采集嶗山奶山羊的乳腺組織,利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,純化后分別轉(zhuǎn)染AANAT和HIOMT基因,檢測這兩個外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)水平和合成褪黑素的水平,以驗(yàn)證是否可以作為轉(zhuǎn)基因的供體細(xì)胞。(1)采取綿羊松果體細(xì)胞中克隆出AANAT和HIOMT基因,使用Xho l酶切并連接,構(gòu)建載體pBC1-AANAT和pBC1-HIOMTo再由質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-his中擴(kuò)增純化得到上下游均添加了Not I酶切位點(diǎn)的Neo片段,通過對Neo擴(kuò)增片段及質(zhì)粒pBC 1-AANAT/pBC 1-HIOMT進(jìn)行Not I單酶切后,連接片段構(gòu)建能夠在真核細(xì)胞進(jìn)行抗性篩選的重組質(zhì)粒pBC 1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo。菌液PCR和酶切驗(yàn)證,結(jié)果表明呈陽性,檢測序列正確。(2)采集泌乳期健康嶗山奶山羊乳腺組織,進(jìn)行組織塊貼壁培養(yǎng)法分離得到兩組山羊乳腺上皮細(xì)胞,利用相差消化法進(jìn)行乳腺上皮細(xì)胞的分離純化。結(jié)果顯示得到純凈的乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞呈鵝卵石樣,排列緊密,高倍顯微鏡下觀察可見多核,呈典型上皮細(xì)胞特征。細(xì)胞生長曲線類似與“S”形,符合細(xì)胞生長的生物學(xué)規(guī)律。(3)使用脂質(zhì)體2000將真核表達(dá)載體pBC1-AANAT-Neo, pBC1-HIOMT-Neo分別轉(zhuǎn)染到嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中,建立了乳腺上皮細(xì)胞的兩種合成酶過表達(dá)系統(tǒng)。通過檢測轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中AANAT和HIOMT的mRNA相對表達(dá)水平,驗(yàn)證表達(dá)載體是否轉(zhuǎn)染成功。使用添加褪黑素合成前體五羥色胺(5-HT)的誘導(dǎo)培養(yǎng)液培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞24 h后,檢測培養(yǎng)液中褪黑素含量。結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染AANAT和HIOMT的乳腺上皮細(xì)胞中都高表達(dá)了相應(yīng)的基因,其合成酶AANAT和HIOMT的mRNA相對表達(dá)量均顯著高于對照組(p0.01)；轉(zhuǎn)染AANAT的乳腺上皮細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中加入五羥色胺(5-HT),培養(yǎng)液中MT濃度顯著高于對照組(p0.01)。表明此轉(zhuǎn)染體系能夠成功獲得轉(zhuǎn)AANAT及HIOMT的嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞,并在存在褪黑素合成前體5-HT的情況下,合成顯著高于對照組的褪黑素量(45.31±2.32 ng/mL vs. 36.14±1.82ng/mL, p0.05)。綜上所述,本研究中的重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC 1-HIOMT-Neo、嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞及轉(zhuǎn)染體系均能用于乳腺反應(yīng)器的上游實(shí)驗(yàn)。
【關(guān)鍵詞】：嶗山奶山羊 乳腺上皮細(xì)胞 AANAT HIOMT 褪黑素 轉(zhuǎn)基因
【學(xué)位授予單位】：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：S827
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-9
• 縮略詞表9-13
• 1 文獻(xiàn)綜述13-25
• 1.1 乳腺上皮細(xì)胞研究史簡述13-19
• 1.1.1 乳腺上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)13-14
• 1.1.2 乳腺上皮細(xì)胞的純化14
• 1.1.3 乳腺反應(yīng)器的研究進(jìn)展14-15
• 1.1.4 褪黑素及其生理功能15-18
• 1.1.5 嶗山奶山羊簡介18
• 1.1.6 褪黑素功能乳的發(fā)展現(xiàn)狀與前景18-19
• 1.2 轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)的研究與應(yīng)用19-25
• 1.2.1 轉(zhuǎn)基因動物的研究19-22
• 1.2.2 轉(zhuǎn)基因動物的應(yīng)用22-23
• 1.2.3 轉(zhuǎn)基因動物的安全性23
• 1.2.4 研究目的與意義23-25
• 2 材料與方法25-44
• 2.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和載體構(gòu)建的材料與方法25-35
• 2.1.1 松果體及質(zhì)粒來源25
• 2.1.2 主要試劑25-26
• 2.1.3 主要儀器與耗材26
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計26
• 2.1.5 松果體總RNA的提取26-27
• 2.1.6 RNA反轉(zhuǎn)錄27-28
• 2.1.7 AANAT、HIOMT基因片段擴(kuò)增28-29
• 2.1.8 目的片段連接轉(zhuǎn)化至pMD~(TM)19-T載體29-30
• 2.1.9 陽性克隆pMD~(TM)19-T-AANAT及pMD~(TM)19-T-HIOMT質(zhì)粒提取及檢測30
• 2.1.10 構(gòu)建表達(dá)載體pBC1-AANAT與pBC1-HIOMT30-31
• 2.1.11 質(zhì)粒pBC1-AANAT/HIOMT及質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-his的純化31
• 2.1.12 質(zhì)粒pcDNA3.1-myc-his Neo元件模板擴(kuò)增及回收31-33
• 2.1.13 Neo元件模板PCR產(chǎn)物和載體酶切,連接33-34
• 2.1.14 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Top 10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞34
• 2.1.15 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鑒定34-35
• 2.1.16 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鑒定35
• 2.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的材料與方法35-39
• 2.2.1 組織來源35
• 2.2.2 主要試劑35-36
• 2.2.3 主要儀器與耗材36-37
• 2.2.4 乳腺組織的取材37
• 2.2.5 乳腺上皮細(xì)胞純化37-38
• 2.2.6 乳腺上皮細(xì)胞傳代培養(yǎng)38
• 2.2.7 乳腺上皮細(xì)胞的凍存和解凍培養(yǎng)38
• 2.2.8 乳腺上皮細(xì)胞生長曲線測定38-39
• 2.3 轉(zhuǎn)褪黑素合成酶基因乳腺上皮細(xì)胞功能驗(yàn)證的材料與方法39-44
• 2.3.1 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞株和菌株來源39
• 2.3.2 主要試劑39
• 2.3.3 主要儀器與耗材39
• 2.3.4 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP的純化39-40
• 2.3.5 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP濃度測定40
• 2.3.6 脂質(zhì)體介導(dǎo)的外源基因轉(zhuǎn)染山羊乳腺上皮細(xì)胞40
• 2.3.7 細(xì)胞總RNA的提取40-41
• 2.3.8 RNA反轉(zhuǎn)錄41-42
• 2.3.9 Real Time PCR42-43
• 2.3.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析43
• 2.3.11 細(xì)胞培養(yǎng)液中褪黑素濃度測定43
• 2.3.12 實(shí)驗(yàn)設(shè)計43-44
• 3 結(jié)果與分析44-57
• 3.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆和載體構(gòu)建結(jié)果44-51
• 3.1.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆結(jié)果44-45
• 3.1.2 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT與pBC1-HIOMT測序結(jié)果45-48
• 3.1.3 Neo元件模板擴(kuò)增結(jié)果48
• 3.1.4 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo克隆鑒定48-49
• 3.1.5 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo酶切鑒定49-50
• 3.1.6 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo/pBC1-HIOMT-Neo圖譜50-51
• 3.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果51-53
• 3.2.1 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的生長特性51-53
• 3.2.2 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞生長曲線53
• 3.3 轉(zhuǎn)褪黑素合成酶基因乳腺上皮細(xì)胞功能驗(yàn)證的結(jié)果53-57
• 3.3.1 重組質(zhì)粒pBC1-AANAT-Neo,pBC1-HIOMT-Neo,空載體pBC1和pIRES2-EGFP的純化53-54
• 3.3.2 空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞驗(yàn)證54
• 3.3.3 轉(zhuǎn)基因AANAT、HIOMT在嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)54-56
• 3.3.4 轉(zhuǎn)基因嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞合成褪黑素檢測56-57
• 4 討論57-61
• 4.1 褪黑素合成酶基因AANAT、HIOMT的克隆57
• 4.2 載體pBC1-AANAT-NEO和PBC1-HIOMT-NEO的乳腺特異性表達(dá)57-58
• 4.3 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)58-59
• 4.4 嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異性表達(dá)載體PBC1-AANAT和PBC1-HIOMT59-61
• 5 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-71
• 致謝71-72

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  本文關(guān)鍵詞：嶗山奶山羊乳腺上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染褪黑素合成酶基因的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：471299