本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟(classical swine fever,CSF)被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須上報(bào)的動(dòng)物烈性傳染病之一,臨床上以高熱稽留、高死亡率、免疫抑制和繁殖障礙為主要特征。CSF的病原是豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員,該屬還包括牛病毒性腹瀉病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、綿羊邊界病病毒(border disease virus,BDV)等成員。CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜糖蛋白Erns、E1、E2和衣殼蛋白C。E2是CSFV重要的毒力因子和主要的保護(hù)性抗原,同時(shí)在病毒的吸附和侵入過程中發(fā)揮重要作用。但迄今為止有關(guān)E2蛋白與宿主細(xì)胞相互作用的研究很少。本研究利用豬巨噬細(xì)胞cDNA酵母表達(dá)文庫(kù)和酵母雙雜交技術(shù)篩選與E2蛋白存在相互作用的宿主蛋白,獲得了17種與E2可能存在相互作用的宿主蛋白,經(jīng)比較分析后選擇硫氧還蛋白2(thioredoxin 2,Trx2)進(jìn)行深入研究。Trx2廣泛表達(dá)于豬的不同組織中。經(jīng)酵母共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證、GST pull-down試驗(yàn)和原位鄰位連接試驗(yàn)(in situ proximity ligation assay,PLA)證明,Trx2蛋白和CSFV E2蛋白存在直接的相互作用。激光共聚焦試驗(yàn)證明,E2蛋白與Trx2蛋白共定位于胞漿。通過Trx2蛋白的三種截短突變體與E2蛋白的GST pull-down試驗(yàn)結(jié)果表明,Trx2蛋白的硫氧還結(jié)構(gòu)域是其與E2蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。為研究Trx2蛋白對(duì)CSFV復(fù)制的調(diào)控作用,我們?cè)O(shè)計(jì)并合成特異性靶向Trx2蛋白的干擾性小RNA分子,通過RNA干擾下調(diào)PK-15細(xì)胞內(nèi)源性Trx2蛋白的表達(dá),結(jié)果表明,沉默Trx2蛋白可顯著促進(jìn)CSFV的增殖和基因組的復(fù)制;將CSFV感染慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定表達(dá)Trx2蛋白的PK-15細(xì)胞系,結(jié)果顯示,過表達(dá)Trx2蛋白后會(huì)顯著抑制CSFV的增殖和基因組的復(fù)制。在CSFV感染后不同時(shí)間點(diǎn)利用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Trx2蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)CSFV感染的PK-15細(xì)胞中Trx2蛋白表達(dá)量明顯低于對(duì)照組;用E2和Trx2表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,結(jié)果顯示,Trx2蛋白的表達(dá)量隨E2蛋白表達(dá)量的增加而減少,這表明,CSFV感染能抑制Trx2蛋白的表達(dá)。總之,本研究確定了Trx2蛋白與E2蛋白的相互作用及其關(guān)鍵區(qū)域,證實(shí)了Trx2蛋白對(duì)CSFV復(fù)制的抑制作用,有助于增進(jìn)我們對(duì)CSFV感染機(jī)制的理解。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 囊膜糖蛋白E2 硫氧還蛋白2 病毒-宿主相互作用 病毒復(fù)制的調(diào)控
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 豬瘟病毒11-15
• 1.1.1 豬瘟病毒11
• 1.1.2 豬瘟病毒囊膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能11-12
• 1.1.3 豬瘟病毒與宿主相互作用研究進(jìn)展12-15
• 1.2 硫氧還蛋白 215-16
• 1.2.1 硫氧還蛋白2的結(jié)構(gòu)15
• 1.2.2 硫氧還蛋白2的功能15-16
• 1.3 研究的目的和意義16-18
• 第二章 Trx2蛋白與CSFV E2蛋白的相互作用及其對(duì)CSFV復(fù)制的調(diào)控作用18-37
• 2.1 材料與方法18-26
• 2.1.1 細(xì)胞、毒株、菌株和載體18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 基因擴(kuò)增與克隆18-20
• 2.1.4 酵母雙雜交篩選與CSFV E2相互作用的宿主蛋白20-21
• 2.1.5 豬體各組織中 Trx2 蛋白表達(dá)豐度的檢測(cè)21
• 2.1.6 Trx2 與 CSFV E2 的酵母共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證21
• 2.1.7 Trx2 的原核表達(dá)及純化21-22
• 2.1.8 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及真核表達(dá)22
• 2.1.9 GST pull-down 試驗(yàn)22
• 2.1.10 原位鄰位連接試驗(yàn)22-23
• 2.1.11 激光共聚焦試驗(yàn)23
• 2.1.12 RNA 干擾試驗(yàn)23-24
• 2.1.13 Trx2 穩(wěn)定表達(dá) PK-15 細(xì)胞系的構(gòu)建24
• 2.1.14 過表達(dá) Trx2 對(duì) CSFV 復(fù)制的影響24
• 2.1.15 CSFV 感染對(duì) Trx2 表達(dá)的影響24-25
• 2.1.16 Western blotting25
• 2.1.17 熒光定量 RT-PCR25
• 2.1.18 間接免疫熒光試驗(yàn)25-26
• 2.1.19 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26
• 2.2 結(jié)果26-35
• 2.2.1 酵母雙雜交篩選與E2相互作用的蛋白26
• 2.2.2 酵母共轉(zhuǎn)化驗(yàn)證Trx2與CSFV E2的相互作用26-27
• 2.2.3 GST pull-down試驗(yàn)驗(yàn)證Trx2與CSFV E2的相互作用27
• 2.2.4 原位鄰位連接試驗(yàn)驗(yàn)證Trx2與CSFV E2的相互作用27-28
• 2.2.5 激光共聚焦試驗(yàn)驗(yàn)證Trx2與CSFV E2的相互作用28-29
• 2.2.6 硫氧還結(jié)構(gòu)域是Trx2與CSFV E2相互作用的關(guān)鍵區(qū)域29-30
• 2.2.7 沉默Trx2促進(jìn)CSFV的增殖30-31
• 2.2.8 過表達(dá)Trx2抑制CSFV的增殖31-32
• 2.2.9 CSFV感染下調(diào)Trx2的表達(dá)32-33
• 2.2.10 CSFV 感染下調(diào) Trx2 的表達(dá)33-34
• 2.2.11 CSFV E2 蛋白劑量依賴性地抑制 Trx2 蛋白的表達(dá)34-35
• 2.3 討論35-37
• 第三章 全文結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-46
• 致謝46-47
• 作者簡(jiǎn)歷47

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 ;Secretory Expression of E2 Main Antigen Domain of CSFV C Strain and the Establishment of Indirect ELISA Assay[J];Virologica Sinica;2008年05期

2 ;A Novel RT-LAMP Assay for Rapid and Simple Detection of Classical Swine Fever Virus[J];Virologica Sinica;2010年01期

3 ;Development of Multiple ELISAs for the Detection of Antibodies against Classical Swine Fever Virus in Pig Sera[J];Virologica Sinica;2012年01期

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長(zhǎng)春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化的研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第六屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

2 史子學(xué);孫金福;郭煥成;涂長(zhǎng)春;;CSFV感染后宿主凋亡相關(guān)基因表達(dá)變化研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第三屆豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

3 李素;郝建偉;孫金福;郭煥成;郭昌明;孫博興;涂長(zhǎng)春;;CSFV感染豬原代血管內(nèi)皮細(xì)胞的差異蛋白質(zhì)組分析[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

4 唐青海;張彥明;郭抗抗;何雷;范麗;仝剛;代晨;;豬瘟病毒(CSFV)NS2蛋白抑制MG132誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)畜牧獸醫(yī)生物技術(shù)學(xué)分會(huì)暨中國(guó)免疫學(xué)會(huì)獸醫(yī)免疫分會(huì)第八次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

5 周遠(yuǎn)成;王琴;范學(xué)政;徐璐;徐志文;郭萬柱;;豬瘟病毒急性感染對(duì)豬外周血淋巴細(xì)胞的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第六屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

6 謝金文;沈志強(qiáng);管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

7 謝金文;沈志強(qiáng);管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)家畜傳染病學(xué)分會(huì)第七屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨第十三次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集（下冊(cè)）[C];2009年

8 杜蘭榮;李云崗;孫圣福;張棟;陳靜;;PRRSV、CSFV和PCV多重PCR檢測(cè)方法的建立及初步應(yīng)用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物傳染病學(xué)分會(huì)第四次豬病防控學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2010年

9 鄭仲華;胡永明;趙明秋;陳金頂;;CSFV強(qiáng)弱毒株RT-PCR快速鑒別檢測(cè)方法研究[A];2012年鄂粵微生物學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)——湖北省暨武漢微生物學(xué)會(huì)成立六十年慶祝大會(huì)論文集[C];2012年

10 劉俊;王琴;范學(xué)政;徐璐;湯波;陳蕾;黃偉;;豬瘟病毒急性感染后病毒載量的動(dòng)態(tài)分布規(guī)律研究[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2008年學(xué)術(shù)年會(huì)暨第六屆全國(guó)畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2008年

  本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對(duì)豬瘟病毒復(fù)制的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號(hào)：387204