本文關(guān)鍵詞：細胞硫氧還蛋白2與豬瘟病毒E2蛋白的相互作用及其對豬瘟病毒復制的調(diào)控作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：豬瘟(classical swine fever,CSF)被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須上報的動物烈性傳染病之一,臨床上以高熱稽留、高死亡率、免疫抑制和繁殖障礙為主要特征。CSF的病原是豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)。CSFV是黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)成員,該屬還包括牛病毒性腹瀉病病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)、綿羊邊界病病毒(border disease virus,BDV)等成員。CSFV的結(jié)構(gòu)蛋白包括囊膜糖蛋白Erns、E1、E2和衣殼蛋白C。E2是CSFV重要的毒力因子和主要的保護性抗原,同時在病毒的吸附和侵入過程中發(fā)揮重要作用。但迄今為止有關(guān)E2蛋白與宿主細胞相互作用的研究很少。本研究利用豬巨噬細胞cDNA酵母表達文庫和酵母雙雜交技術(shù)篩選與E2蛋白存在相互作用的宿主蛋白,獲得了17種與E2可能存在相互作用的宿主蛋白,經(jīng)比較分析后選擇硫氧還蛋白2(thioredoxin 2,Trx2)進行深入研究。Trx2廣泛表達于豬的不同組織中。經(jīng)酵母共轉(zhuǎn)化驗證、GST pull-down試驗和原位鄰位連接試驗(in situ proximity ligation assay,PLA)證明,Trx2蛋白和CSFV E2蛋白存在直接的相互作用。激光共聚焦試驗證明,E2蛋白與Trx2蛋白共定位于胞漿。通過Trx2蛋白的三種截短突變體與E2蛋白的GST pull-down試驗結(jié)果表明,Trx2蛋白的硫氧還結(jié)構(gòu)域是其與E2蛋白相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。為研究Trx2蛋白對CSFV復制的調(diào)控作用,我們設(shè)計并合成特異性靶向Trx2蛋白的干擾性小RNA分子,通過RNA干擾下調(diào)PK-15細胞內(nèi)源性Trx2蛋白的表達,結(jié)果表明,沉默Trx2蛋白可顯著促進CSFV的增殖和基因組的復制;將CSFV感染慢病毒介導的穩(wěn)定表達Trx2蛋白的PK-15細胞系,結(jié)果顯示,過表達Trx2蛋白后會顯著抑制CSFV的增殖和基因組的復制。在CSFV感染后不同時間點利用Western blotting檢測細胞內(nèi)Trx2蛋白的表達情況,發(fā)現(xiàn)CSFV感染的PK-15細胞中Trx2蛋白表達量明顯低于對照組;用E2和Trx2表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,結(jié)果顯示,Trx2蛋白的表達量隨E2蛋白表達量的增加而減少,這表明,CSFV感染能抑制Trx2蛋白的表達�？傊�,本研究確定了Trx2蛋白與E2蛋白的相互作用及其關(guān)鍵區(qū)域,證實了Trx2蛋白對CSFV復制的抑制作用,有助于增進我們對CSFV感染機制的理解。
【關(guān)鍵詞】：豬瘟病毒 囊膜糖蛋白E2 硫氧還蛋白2 病毒-宿主相互作用 病毒復制的調(diào)控
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S852.651
【目錄】：

• 摘要6-7
• Abstract7-10
• 英文縮略表10-11
• 第一章 引言11-18
• 1.1 豬瘟病毒11-15
• 1.1.1 豬瘟病毒11
• 1.1.2 豬瘟病毒囊膜糖蛋白的結(jié)構(gòu)和功能11-12
• 1.1.3 豬瘟病毒與宿主相互作用研究進展12-15
• 1.2 硫氧還蛋白 215-16
• 1.2.1 硫氧還蛋白2的結(jié)構(gòu)15
• 1.2.2 硫氧還蛋白2的功能15-16
• 1.3 研究的目的和意義16-18
• 第二章 Trx2蛋白與CSFV E2蛋白的相互作用及其對CSFV復制的調(diào)控作用18-37
• 2.1 材料與方法18-26
• 2.1.1 細胞、毒株、菌株和載體18
• 2.1.2 主要試劑18
• 2.1.3 基因擴增與克隆18-20
• 2.1.4 酵母雙雜交篩選與CSFV E2相互作用的宿主蛋白20-21
• 2.1.5 豬體各組織中 Trx2 蛋白表達豐度的檢測21
• 2.1.6 Trx2 與 CSFV E2 的酵母共轉(zhuǎn)化驗證21
• 2.1.7 Trx2 的原核表達及純化21-22
• 2.1.8 細胞轉(zhuǎn)染及真核表達22
• 2.1.9 GST pull-down 試驗22
• 2.1.10 原位鄰位連接試驗22-23
• 2.1.11 激光共聚焦試驗23
• 2.1.12 RNA 干擾試驗23-24
• 2.1.13 Trx2 穩(wěn)定表達 PK-15 細胞系的構(gòu)建24
• 2.1.14 過表達 Trx2 對 CSFV 復制的影響24
• 2.1.15 CSFV 感染對 Trx2 表達的影響24-25
• 2.1.16 Western blotting25
• 2.1.17 熒光定量 RT-PCR25
• 2.1.18 間接免疫熒光試驗25-26
• 2.1.19 統(tǒng)計學分析26
• 2.2 結(jié)果26-35
• 2.2.1 酵母雙雜交篩選與E2相互作用的蛋白26
• 2.2.2 酵母共轉(zhuǎn)化驗證Trx2與CSFV E2的相互作用26-27
• 2.2.3 GST pull-down試驗驗證Trx2與CSFV E2的相互作用27
• 2.2.4 原位鄰位連接試驗驗證Trx2與CSFV E2的相互作用27-28
• 2.2.5 激光共聚焦試驗驗證Trx2與CSFV E2的相互作用28-29
• 2.2.6 硫氧還結(jié)構(gòu)域是Trx2與CSFV E2相互作用的關(guān)鍵區(qū)域29-30
• 2.2.7 沉默Trx2促進CSFV的增殖30-31
• 2.2.8 過表達Trx2抑制CSFV的增殖31-32
• 2.2.9 CSFV感染下調(diào)Trx2的表達32-33
• 2.2.10 CSFV 感染下調(diào) Trx2 的表達33-34
• 2.2.11 CSFV E2 蛋白劑量依賴性地抑制 Trx2 蛋白的表達34-35
• 2.3 討論35-37
• 第三章 全文結(jié)論37-38
• 參考文獻38-46
• 致謝46-47
• 作者簡歷47

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 ;Secretory Expression of E2 Main Antigen Domain of CSFV C Strain and the Establishment of Indirect ELISA Assay[J];Virologica Sinica;2008年05期

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中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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7 謝金文;沈志強;管宇;韓玲;任艷玲;曲光剛;;CSFV、PRRSV雙重RT-PCR檢測方法的建立及其應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會家畜傳染病學分會第七屆全國會員代表大會暨第十三次學術(shù)研討會論文集（下冊）[C];2009年

8 杜蘭榮;李云崗;孫圣福;張棟;陳靜;;PRRSV、CSFV和PCV多重PCR檢測方法的建立及初步應用[A];中國畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病學分會第四次豬病防控學術(shù)研討會論文集[C];2010年

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10 劉俊;王琴;范學政;徐璐;湯波;陳蕾;黃偉;;豬瘟病毒急性感染后病毒載量的動態(tài)分布規(guī)律研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學會2008年學術(shù)年會暨第六屆全國畜牧獸醫(yī)青年科技工作者學術(shù)研討會論文集[C];2008年

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本文編號：387204