發(fā)布時間：2023-10-14 09:23

　　雞球蟲病是由幾種艾美耳球蟲寄生雞腸道引起的一種嚴重的寄生蟲病。目前,該病主要還是依賴于藥物防治,抗球蟲藥物的廣泛使用也加劇了球蟲耐藥性的產(chǎn)生。然而至今都沒有找到球蟲耐藥性形成的機制,也沒有找到控制球蟲產(chǎn)生耐藥性的靶基因。為了深入研究球蟲耐藥性產(chǎn)生的分子機制,我們實驗室前期以柔嫩艾美耳球蟲敏感株為基礎分別誘導了對地克珠利和馬杜拉霉素耐藥的蟲株,并利用轉錄組測序的方法對這兩株耐藥株以及柔嫩艾美耳球蟲敏感株進行比較分析,成功獲得了在敏感株和耐藥株中差異表達的基因。本研究從差異表達基因中,選取了在兩株耐藥株中均顯著上調表達的2個基因進行相關研究,這2個基因為柔嫩艾美耳球蟲絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(EtSTP)和ASNA1同源ATP酶(EtASNA1)。1.EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表達以柔嫩艾美耳球蟲敏感株cDNA第一鏈為模板,成功克隆了 EtSTP和EtASNA1基因,核苷酸序列分析表明,EtSTP的開放閱讀框序列含528 bp,編碼175個氨基酸殘基,預測分子量為19.0 kDa;EtASNA1的開放閱讀框序列含408 bp,編碼135個氨基酸殘基,預測分子量為14.6 kDa...

【文章頁數(shù)】：80 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
英文縮略表
第1章 文獻綜述
    1.1 雞球蟲病概述
    1.2 抗球蟲藥物作用機理及耐藥機制
        1.2.1 聚醚離子載體類藥物
        1.2.2 化學合成類
    1.3 雞球蟲耐藥性的檢測方法
        1.3.1 籠飼試驗
        1.3.2 細胞檢測
    1.4 耐藥蟲株的誘導
    1.5 耐藥相關基因的研究
    1.6 展望
第2章 EtSTP和EtASNA1基因的克隆和表達
    2.1 引言
    2.2 材料和方法
        2.2.1 實驗蟲株和實驗動物
        2.2.2 實驗試劑
        2.2.3 實驗儀器
        2.2.4 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊的收集與純化
        2.2.5 孢子化卵囊總RNA的提取和cDNA第一鏈的制備
        2.2.6 基因的克隆及生物信息學分析
        2.2.7 原核重組表達質粒的構建
        2.2.8 重組蛋白的表達與純化
        2.2.9 重組蛋白反應原性的檢測
    2.3 實驗結果
        2.3.1 柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊的收集與純化
        2.3.2 孢子化卵囊總RNA的提取
        2.3.3 基因的克隆和序列分析
        2.3.4 重組蛋白的表達與純化
        2.3.5 重組蛋白反應原性的分析
    2.4 討論
第3章 EtSTP與EtASNA1蛋白特性和功能的初步分析
    3.1 引言
    3.2 材料和方法
        3.2.1 實驗蟲株、動物和細胞
        3.2.2 實驗試劑
        3.2.3 實驗儀器
        3.2.4 柔嫩艾美耳球蟲敏感株四個階段蟲體的收集與純化
        3.2.5 qPCR分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲敏感株四個發(fā)育階段的mRNA轉錄水平
        3.2.6 重組蛋白多克隆抗體的制備及IgG的純化
        3.2.7 Western Blot分析EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲敏感株四個發(fā)育階段的蛋白翻譯水平
        3.2.8 EtSTP和EtASNA1在蟲體中的分布定位
        3.2.9 兔抗重組蛋白多克隆抗體對子孢子入侵DF-1細胞的影響
        3.2.10 數(shù)據(jù)分析
    3.3 結果
        3.3.1 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的mRNA轉錄水平
        3.3.2 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲不同發(fā)育階段的翻譯水平
        3.3.3 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲體內的分布定位
        3.3.4 兔抗重組蛋白rEtSTP和rEtASNA1多克隆抗體對子孢子體外入侵DF-1細胞的影響
    3.4 討論
第4章 EtSTP和EtASNA1在柔嫩艾美耳球蟲敏感株與耐藥株中的差異分析
    4.1 引言
    4.2 材料和方法
        4.2.1 實驗蟲株和實驗動物
        4.2.2 實驗試劑
        4.2.3 實驗儀器
        4.2.4 柔嫩艾美耳球蟲耐藥株的傳代,收集與純化
        4.2.5 敏感株與耐藥株第二代裂殖子超微結構比較
        4.2.6 藥物孵育對子孢子入侵DF-1細胞的影響
        4.2.7 RNA的提取和cDNA第一鏈的合成
        4.2.8 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐藥株中DNA的擴增與比較
        4.2.9 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐藥株中轉錄水平的分析
        4.2.10 EtSTP和EtASNA1在敏感株和耐藥株中蛋白翻譯水平的分析
    4.3 結果
        4.3.1 敏感株與耐藥株第二代裂殖子的透射電鏡觀察
        4.3.2 藥物孵育對子孢子入侵DF-1細胞的影響
        4.3.3 比較敏感株和耐藥株EtSTP和EtASNA1的DNA序列
        4.3.4 EtSTP在敏感株和地克珠利耐藥株及馬杜拉霉素耐藥株中的表達水平
        4.3.5 EtASNA1在敏感株和地克珠利耐藥株及馬杜拉霉素耐藥株中的表達水平
    4.4 討論
第5章 qPCR檢測EtSTP和EtASNA1在不同耐藥株中的轉錄水平
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 實驗蟲株和實驗動物
        5.2.2 實驗試劑
        5.2.3 實驗儀器
        5.2.4 不同濃度耐藥株轉錄水平的研究
        5.2.5 野生地克珠利耐藥株轉錄水平的研究
        5.2.6 藥物作用后對EtSTP和EtASNA1轉錄水平的影響
    5.3 結果
        5.3.1 EtSTP和EtASNA1在不同濃度耐藥株轉錄水平的比較
        5.3.2 野生地克珠利耐藥株中EtSTP和EtASNA1的mRNA轉錄水平的研究
        5.3.3 體外培養(yǎng)觀察藥物作用蟲體后對EtSTP和EtASNA1 mRNA轉錄水平的影響
        5.3.4 體內試驗觀察藥物作用蟲體后對EtSTP和EtASNA1轉錄水平的影響
    5.4 討論
第6章 全文總結
參考文獻
攻讀學位期間取得的研究成果
致謝



本文編號：3854044