受精是哺乳動(dòng)物有性生殖的基本過(guò)程,精卵融合是受精過(guò)程的關(guān)鍵步驟,它是由多個(gè)分子共同參與并協(xié)助完成的過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn),哺乳動(dòng)物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1與卵子的JUNO相互作用外,還需要PDIA3、CRISP2、SPACA3以及SPACA1等多種其他精子或卵子上的蛋白相互作用。本研究用酵母雙雜交和免疫共沉淀技術(shù)在分子水平上鑒定了大鼠SPACA1與SPACA3之間的相互作用。并利用間接免疫熒光技術(shù)對(duì)SPACA1與SPACA3、PDIA3與SPACA3、PDIA3與CRISP2在大鼠和綿羊精子上進(jìn)行共定位。為全面理解精卵融合的分子機(jī)制提供了新的資料。首先,我們克隆了大鼠spaca1和spaca3的cDNA及綿羊pdia3、crisp2和spaca3的cDNA,構(gòu)建pGBK-spaca1與pGAD-spaca3酵母表達(dá)載體和pCMV-C-HA-spaca1與pCMV-C-Flag-spaca3真核表達(dá)載體,分別用酵母雙雜交和免疫共沉淀的實(shí)驗(yàn)方法鑒定發(fā)現(xiàn)SPACA1與SPACA3之間存在相互作用。鑒定蛋白的細(xì)胞和亞細(xì)胞定位需要抗體。為了制備大鼠SPACA1和SPACA3以及綿羊PDIA...

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【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
符號(hào)說(shuō)明
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 精子的成熟
    1.2 精子獲能
    1.3 頂體反應(yīng)與膜融合
    1.4 精卵融合相關(guān)蛋白
        1.4.1 精子頂體相關(guān)(Sperm acrosome associated,SPACA)蛋白家族
            1.4.1.1 精子頂體相關(guān)蛋白 3(Sperm acrosome associated 3,SPACA3)
            1.4.1.2 精子頂體相關(guān)蛋白1(Sperm acrosome associated 1,SPACA1)
        1.4.2 蛋白二硫異構(gòu)酶A家族成員PDIA3
        1.4.3 富含半胱氨酸的分泌蛋白家族成員CRISP2
        1.4.4 免疫球蛋白超家族成員IZUMO1
    1.5 與精卵融合相關(guān)蛋白(SPACA1/SPACA3/PDIA3/CRISP2/IZUMO1)相互作用的蛋白
    1.6 小結(jié)
第二章 SPACA1和SPACA3 的相互作用鑒定
    引言
    2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備
        2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑
        2.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)菌種
        2.1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及載體
        2.1.5 實(shí)驗(yàn)常用溶液的配制
    2.2 實(shí)驗(yàn)方法
        2.2.1 大鼠睪丸組織總RNA的提取
        2.2.2 大鼠睪丸組織cDNA的合成
        2.2.3 大鼠睪丸組織cDNA的檢測(cè)
        2.2.4 大鼠spaca1和spaca3 CDS區(qū)全長(zhǎng)的克隆
            2.2.4.1 大鼠spaca1與spaca3 CDS全長(zhǎng)克隆引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.4.2 大鼠spaca1與spaca3 CDS區(qū)全長(zhǎng)克隆
            2.2.4.3 大鼠pMD19-T-spaca1與pMD19-T-spaca3 重組載體的構(gòu)建
        2.2.5 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
            2.2.5.1 大鼠spaca1與spaca3 亞克隆(酵母)引物的設(shè)計(jì)與合成
            2.2.5.2 大鼠spaca1與spaca3 過(guò)渡載體的構(gòu)建
            2.2.5.3 大鼠spaca1與spaca3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.5.4 LiAc法制備酵母感受態(tài)
            2.2.5.5 pGAD-spaca3與pGBK-spaca1 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞
            2.2.5.6 酵母雙雜交
        2.2.6 免疫共沉淀驗(yàn)實(shí)驗(yàn)
            2.2.6.1 大鼠spaca1與spaca3 的亞克隆(真核)與真核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.2.6.1.1 大鼠spaca1與spaca3 的亞克隆(真核)引物的設(shè)計(jì)
                2.2.6.1.2 大鼠spaca1與spaca3 過(guò)渡載體的構(gòu)建
                2.2.6.1.3 大鼠spaca1與spaca3 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.6.2 293 細(xì)胞的培養(yǎng)
                2.2.6.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇
                2.2.6.2.2 細(xì)胞傳代
                2.2.6.2.3 細(xì)胞鋪板與轉(zhuǎn)染
            2.2.6.3 磁珠法免疫沉淀目標(biāo)蛋白
                2.2.6.3.1 Western-Blot檢測(cè)免疫共沉淀結(jié)果
        2.2.7 SPACA1與SPACA3 多克隆抗體的制備
            2.2.7.1 大鼠spaca1與spaca3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                2.2.7.1.1 大鼠p MD19-T-spaca1與pMD19-T-spaca3 過(guò)渡載體的構(gòu)建
                2.2.7.1.2 大鼠pET-28a-spaca1與pET-28a-spaca3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.2.7.2 大鼠SPACA1-HIS與 SPACA3-HIS融合蛋白表達(dá)
            2.2.7.3 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白SDS-PAGE鑒定
            2.2.7.4 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白Western-Blot鑒定
            2.2.7.5 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS融合蛋白切膠純化
            2.2.7.6 大鼠SPACA1-HIS和 SPACA3-HIS蛋白濃度測(cè)定
            2.2.7.7 SPACA3與SPACA1 多克隆抗體的制備及鑒定
                2.2.7.7.1 SPACA1-HIS與 SPACA3-HIS免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
                2.2.7.7.2 S180腹水瘤細(xì)胞的培養(yǎng)
                2.2.7.7.3 SPACA1與SPACA3 多克隆抗體的特異性識(shí)別檢測(cè)
        2.2.8 SPACA1與SPACA3 在大鼠睪丸組織中的定位
        2.2.9 SPACA1與SPACA3 在大鼠精子頂體反應(yīng)前后的定位
    2.3 結(jié)果
        2.3.1 大鼠睪丸組織cDNA檢測(cè)
        2.3.2 大鼠spaca1與spaca3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.2.1 大鼠spaca1與spaca3 CDS區(qū)全長(zhǎng)的克隆
            2.3.2.2 pMD19-T-spaca1與p MD19-T-spaca3 的雙酶切鑒定
            2.3.2.3 pGBK-spaca1與pGAD-spaca3 酵母表達(dá)載體的構(gòu)建
        2.3.3 酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)
            2.3.3.1 pGBK-spaca1與pGAD-spaca3 轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)菌落PCR鑒定
            2.3.3.2 酵母雙雜交
        2.3.4 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
            2.3.4.1 大鼠spaca3與spaca1 真核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.4.2 免疫共沉淀
        2.3.5 大鼠SPACA3與SPACA1 抗體的制備
            2.3.5.1 大鼠pET-28a-spaca3與pET-28a-spaca1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            2.3.5.2 大鼠SPACA3-HIS與 SPACA1-HIS原核蛋白的表達(dá)以及鑒定
            2.3.5.3 大鼠SPACA3-HIS與 SPACA1-HIS原核蛋白的純化以及鑒定
            2.3.5.4 大鼠SPACA3-HIS與 SPACA1-HIS融合蛋白的濃度測(cè)定
            2.3.5.5 SPACA3與SPACA1 多克隆抗體的制備及檢測(cè)
        2.3.6 SPACA3與SPACA1 在大鼠睪丸組織中的定位
        2.3.7 SPACA3與SPACA1 在大鼠精子上的共定位
        2.3.8 利用Image J軟件分析SPACA3與SPACA1 的共定位結(jié)果
    2.4 討論
        2.4.1 SPACA1與SPACA3 在生殖組織和生殖細(xì)胞中的定位分析
        2.4.2 SPACA1與SPACA3 相互作用的分析
    2.5 本章小結(jié)和創(chuàng)新點(diǎn)
        2.5.1 小結(jié)
        2.5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
第三章 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在綿羊精子上的共定位
    3.1 引言
    3.2 實(shí)驗(yàn)材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法
            3.2.2.1 綿羊睪丸組織總RNA的提取及c DNA的合成與檢測(cè)
            3.2.2.2 綿羊pdia3、crisp2和spaca3克隆載體的構(gòu)建
                3.2.2.2.1 綿羊pdia3、crisp2和spaca3克隆引物的設(shè)計(jì)
                3.2.2.2.2 綿羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS區(qū)全長(zhǎng)的克隆
                3.2.2.2.3 綿羊p MD19-T-pdia3、pMD19-T-crisp2和p MD19-T-spaca3 克隆載體的構(gòu)建
            3.2.2.3 綿羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 多克隆抗體的制備
                3.2.2.3.1 綿羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                    3.2.2.3.1.1 綿羊pdia3、crisp2和spaca3 過(guò)渡載體的構(gòu)建
                    3.2.2.3.1.2 pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
                3.2.2.3.2 綿羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的表達(dá)與鑒定
                3.2.2.3.3 綿羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的鑒定
                3.2.2.3.4 綿羊PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST融合蛋白的純化及鑒定
                3.2.2.3.5 純化后的PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            3.2.2.4 PDIA3-GST、CRISP2-GST和 SPACA3-GST多克隆抗體的檢測(cè)和純化
            3.2.2.5 PDIA3、CRISP2和SPACA3 在綿羊精子頂體反應(yīng)前后的共定位
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 綿羊睪丸組織cDNA檢測(cè)結(jié)果
        3.3.2 綿羊pdia3、crisp2和spaca3 克隆載體的構(gòu)建
            3.3.2.1 綿羊pdia3、crisp2和spaca3 CDS區(qū)全長(zhǎng)的克隆
            3.3.2.2 綿羊pMD19-T-pdia3、p MD19-T-crisp2和pMD19-T-spaca3 的構(gòu)建
        3.3.3 綿羊PDIA3、CRISP2和SPACA3 血清及腹水多克隆抗體的制備
            3.3.3.1 綿羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建
            3.3.3.2 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的表達(dá)與鑒定
            3.3.3.3 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST融合蛋白的純化及鑒定
            3.3.3.4 PDIA3-GST/CRISP2-GST/SPACA3-GST多克隆抗體的檢測(cè)與純化
        3.3.4 PDIA3、CRISP2以及SPACA3 在綿羊精子頂體反應(yīng)前后的定位
        3.3.5 利用Image J軟件分析PDIA3、CRISP2和SPACA3 在綿羊精子上的共定位結(jié)果
    3.4 討論
        3.4.1 PDIA3與CRISP2 共定位分析
        3.4.2 PDIA3與SPACA3 共定位分析
    3.5 本章小結(jié)和創(chuàng)新點(diǎn)
        3.5.1 小結(jié)
        3.5.2 創(chuàng)新點(diǎn)
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀碩士期間參與的科研項(xiàng)目和發(fā)表論文



本文編號(hào)：3804098