本文關(guān)鍵詞：3株野鳥源H7亞型禽流感病毒分離鑒定、遺傳進(jìn)化及感染性分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：本研究在2010年1月份采自湖南小白額雁和青頭潛鴨樣品中分離到2株H7亞型禽流感病毒,分別命名為A/Lesser White-fronted Goose/HuNan/412/2010(H7N7)(L-412)和A/Baer's Pochard/HuNan/414/2010(H7N 1)(29Y);同年秋季在采自吉林向海地區(qū)的紅頭潛鴨樣品中分離到1株H7亞型禽流感病毒,命名為A/Common Pochard/XiangHai/ 420/2010(H7N1)(865).通過(guò)RT-PCR試驗(yàn)和基因測(cè)序,成功獲得了3株分離株的全基因序列。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步對(duì)3株分離株進(jìn)行了遺傳進(jìn)化、感染性和受體結(jié)合特性分析,具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：1.3株野鳥源H7亞型AIV毒株的分離鑒定、遺傳進(jìn)化分析3株分離株的8個(gè)基因都位于歐亞分支內(nèi),分離株L-412有6個(gè)基因來(lái)源于韓國(guó)野鳥分離株,NS基因與部分北美毒株、2003年荷蘭H7N7亞型人流感毒株基因核苷酸同源性很高,為98.2%和97.7%。L-412是由亞洲不同毒株的片段重組而成,并且NS基因存在歐亞、北美分支以及跨物種之間的交流。分離株29Y和865的8個(gè)基因彼此之間高度同源,均來(lái)自于歐亞毒株,2株分離株的PB1基因與2013年意大利和2003年荷蘭人流感毒株、2008年韓國(guó)豬流感毒株基因核苷酸同源性在97%以上,NP基因則與某些人流感、豬流感、北美毒株屬于同一分支,NS基因與某些北美毒株、2003年荷蘭H7N7亞型人流感毒株基因核苷酸同源性很高,為98.2%和97.7%。通過(guò)多氨基酸序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),3株分離株的NS基因42位突變?yōu)镾,推斷此3株分離株對(duì)小鼠有較高的毒力。2.HA蛋白裂解位點(diǎn)附近氨基酸分析3株分離株的HA蛋白裂解位點(diǎn)附近氨基酸序列分別為PEIPKGR↓GLFGAI、PELPKGR↓GLFGAI和PELPKGR↓GLFGAI,符合低致病性禽流感病毒的序列特征。3.L-412對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析L-412以106EID50的劑量以滴鼻、點(diǎn)眼的方式感染SPF雞、SPF鴨,觀察21d。雞、鴨感染后均以泄殖腔排毒為主,能在多個(gè)臟器內(nèi)檢測(cè)到；在第14d檢測(cè)到抗體。說(shuō)明該毒株在雞、鴨體內(nèi)皆可復(fù)制,但是只在雞個(gè)體之間水平傳播。4.29Y對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析29Y以106EID50的劑量感染SPF雞、SPF鴨和鼠,觀察21d。雞、鴨感染后在咽喉、泄殖腔內(nèi)均檢測(cè)不到病毒,僅能在個(gè)別臟器內(nèi)檢測(cè)到病毒,在第14d檢測(cè)到抗體；攻毒組的鼠在肺臟內(nèi)均可檢測(cè)到病毒。說(shuō)明該毒株既能夠輕度感染雞、鴨和鼠,并且在鴨個(gè)體之間發(fā)生水平傳播。5.865對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析865以上述方法感染SPF雞、SPF鴨和鼠。雞、鴨感染后均可以在咽喉、泄殖腔和多個(gè)臟器內(nèi)檢測(cè)到病毒。在第14d檢測(cè)到抗體。攻毒組的鼠在鼻洗液和肺臟內(nèi)均可檢測(cè)到病毒。說(shuō)明該毒株既能夠感染雞、鴨也能感染鼠,并且在雞／鴨個(gè)體之間均可發(fā)生水平傳播。6.3株H7亞型AIV毒株的受體結(jié)合特性的分析利用a-2,3-sialidase和VCNA處理雞紅細(xì)胞。根據(jù)血凝試驗(yàn)結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)3株分離株既能結(jié)合SAa-2,3Ga1受體,又能結(jié)合SAa-2,6Ga1受體。說(shuō)明3株分離株既能夠感染禽類,還能感染哺乳動(dòng)物。
【關(guān)鍵詞】：野鳥 H7亞型流感病毒 全基因組測(cè)序 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析 致病性試驗(yàn)
【學(xué)位授予單位】：東北林業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S852.65
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-12
• 1 緒論12-21
• 1.1 禽流感病毒的研究進(jìn)展12-17
• 1.1.1 AIV的發(fā)現(xiàn)及其發(fā)展歷史12-13
• 1.1.2 AIV的分類地位及其命名13
• 1.1.3 AIV的化學(xué)組成及對(duì)理化因素的抵抗力13-14
• 1.1.4 AIV的增殖14
• 1.1.5 AIV的病毒基因組及其編碼的蛋白14-15
• 1.1.6 AIV的血凝活性15
• 1.1.7 AIV的流行病學(xué)研究15-17
• 1.2 H7亞型AIV的流行現(xiàn)狀17
• 1.3 H7亞型流感病毒的某些生物學(xué)特性17-18
• 1.4 禽流感病毒致病性的分子基礎(chǔ)18-20
• 1.4.1 血凝素(HA)基因?qū)χ虏⌒缘挠绊?/span>18
• 1.4.2 神經(jīng)氨酸酶(NA)基因?qū)χ虏⌒缘挠绊?/span>18
• 1.4.3 聚合酶(PB2、PB1、PA)基因?qū)χ虏⌒缘挠绊?/span>18-19
• 1.4.4 非結(jié)構(gòu)蛋白(NS)基因?qū)χ虏⌒缘挠绊?/span>19
• 1.4.5 基質(zhì)蛋白(M)基因?qū)χ虏⌒缘挠绊?/span>19-20
• 1.5 本課題研究的目的和意義20-21
• 2 3株野鳥源H7亞型AIV毒株的分離鑒定、遺傳進(jìn)化分析21-55
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21
• 2.1.1 樣品來(lái)源21
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及配方21
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器21
• 2.1.4 雞胚及紅細(xì)胞21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法21-26
• 2.2.1 拭子采集和處理21-22
• 2.2.2 病毒的分離22
• 2.2.3 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)22
• 2.2.4 AIV的RT-PCR檢測(cè)22-23
• 2.2.5 PCR結(jié)果鑒定23
• 2.2.6 血凝素(HA)亞型的鑒定23-25
• 2.2.7 AIV神經(jīng)氨酸酶(NA)亞型的鑒定25
• 2.2.8 病毒全基因組基因擴(kuò)增與測(cè)序25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析26-47
• 2.3.1 病毒分離鑒定結(jié)果26
• 2.3.2 HA亞型的鑒定26
• 2.3.3 NA亞型的鑒定26-27
• 2.3.4 病毒全基因的擴(kuò)增和測(cè)序27-28
• 2.3.5 基因遺傳進(jìn)化分析28-37
• 2.3.6 基因同源性分析結(jié)果37-46
• 2.3.7 血凝素蛋白裂解位點(diǎn)46
• 2.3.8 糖基化位點(diǎn)分析46-47
• 2.3.9 受體結(jié)合位點(diǎn)47
• 2.4 討論47-54
• 2.4.1 H7基因的分子遺傳分析47-49
• 2.4.2 N1基因的分子遺傳分析49-50
• 2.4.3 N7基因的分子遺傳分析50
• 2.4.4 PB2基因的分子遺傳分析50-51
• 2.4.5 PB1基因的分子遺傳分析51
• 2.4.6 PA基因的分子遺傳分析51-52
• 2.4.7 NP基因的分子遺傳分析52
• 2.4.8 M基因的分子遺傳分析52-53
• 2.4.9 NS基因的分子遺傳分析53-54
• 2.5 小結(jié)54-55
• 3 L-412對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析55-62
• 3.1 材料55
• 3.1.1 毒株55
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物55
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器55
• 3.2 方法55-56
• 3.2.1 病毒的純化與保存55
• 3.2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))的測(cè)定55
• 3.2.3 SPF雞、鴨感染性試驗(yàn)55-56
• 3.2.4 雞、鴨臟器和拭子的滴定56
• 3.2.5 血凝抑制試驗(yàn)(HI)56
• 3.3 結(jié)果56-60
• 3.3.1 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))結(jié)果56-57
• 3.3.2 SPF雞感染性試驗(yàn)57-58
• 3.3.3 SPF鴨感染性試驗(yàn)58-59
• 3.3.4 兩組實(shí)驗(yàn)的對(duì)比結(jié)果59-60
• 3.4 討論60-61
• 3.4.1 兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比60-61
• 3.5 小結(jié)61-62
• 4 29Y對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析62-68
• 4.1 材料62
• 4.1.1 毒株62
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物62
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器62
• 4.2 方法62
• 4.2.1 病毒的純化與保存62
• 4.2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))的測(cè)定62
• 4.2.3 SPF雞/鴨和鼠感染性試驗(yàn)62
• 4.2.4 雞/鴨/鼠臟器和拭子的滴定62
• 4.2.5 血凝抑制試驗(yàn)(HI)62
• 4.3 結(jié)果62-67
• 4.3.1 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))結(jié)果62-63
• 4.3.2 SPF雞感染性試驗(yàn)63-64
• 4.3.3 SPF鴨感染性試驗(yàn)64-65
• 4.3.4 SPF鼠感染性試驗(yàn)65
• 4.3.5 雞/鴨/鼠臟器的病理切片結(jié)果65-67
• 4.4 討論67
• 4.4.1 雞/鴨/鼠感染性試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比67
• 4.5 小結(jié)67-68
• 5 865對(duì)不同動(dòng)物的感染性分析68-76
• 5.1 材料68
• 5.1.1 毒株68
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物68
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器68
• 5.2 方法68
• 5.2.1 病毒的純化與保存68
• 5.2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))的測(cè)定68
• 5.2.3 SPF雞/鴨和鼠感染性試驗(yàn)68
• 5.2.4 雞/鴨/鼠臟器和拭子的滴定68
• 5.2.5 血凝抑制試驗(yàn)(HI)68
• 5.3 結(jié)果68-73
• 5.3.1 雞胚半數(shù)感染量(EID_(50))結(jié)果68-69
• 5.3.2 SPF雞感染性試驗(yàn)69-70
• 5.3.3 SPF鴨感染性試驗(yàn)70-71
• 5.3.4 SPF鼠感染性試驗(yàn)71
• 5.3.5 雞/鴨/鼠臟器的病理切片結(jié)果71-73
• 5.4 29Y和865在雞/鴨/鼠各臟器內(nèi)復(fù)制情況73-74
• 5.5 討論74-75
• 5.5.1 雞/鴨/鼠感染性試驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比74
• 5.5.2 29Y和865對(duì)雞/鴨/鼠試驗(yàn)結(jié)果對(duì)比74-75
• 5.6 小結(jié)75-76
• 6 3株H7亞型AIV毒株的受體結(jié)合特性分析76-79
• 6.1 材料76
• 6.1.1 主要試劑76
• 6.1.2 毒株76
• 6.2 方法76-77
• 6.2.1 測(cè)定L-412,29Y和865的受體結(jié)合特性76-77
• 6.3 結(jié)果77-78
• 6.3.1 受體結(jié)合特性分析77-78
• 6.4 討論78
• 6.5 小結(jié)78-79
• 結(jié)論79-80
• 參考文獻(xiàn)80-88
• 附錄88-98
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文98-99
• 致謝99-100

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