落葉松(Larix kaempferi)是一種落葉喬木,具有早期速生、抗逆性強、抗病優(yōu)良、生態(tài)效益好的特點,是我國北方地區(qū)十分重要的造林樹種,被廣泛應(yīng)用于防護林及退耕還林建設(shè)。但由于落葉松生長周期長、無性擴繁技術(shù)復(fù)雜且效率低,一定程度上制約了其遺傳改良進程。隨著現(xiàn)代基因工程技術(shù)的日趨成熟及基于CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)的發(fā)展,為落葉松重要性狀快速改良帶來了機遇。然而,目前落葉松參考基因組序列圖譜組裝仍未完成、遺傳轉(zhuǎn)化體系尚不成熟、基因組工程核心元件儲備有限,使得基于基因組工程的落葉松種質(zhì)創(chuàng)新操作難以有效實施。針對以上落葉松基因組工程實踐中的瓶頸問題,本研究首先構(gòu)建基于原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體系的落葉松瞬時表達檢測體系,其次基于“基因組-轉(zhuǎn)錄組”通量測序比對分析策略進行落葉松高活性啟動子挖掘,進而針對落葉松基因組結(jié)構(gòu)及表達特性構(gòu)建有效的外源基因過表達及內(nèi)源位點基因組編輯系統(tǒng)。本研究主要結(jié)果如下:1、確認(rèn)了落葉松原生質(zhì)體分離、提取、純化及轉(zhuǎn)化關(guān)鍵參數(shù),有效建立了落葉松原生質(zhì)體瞬時表達體系:針對落葉松原生質(zhì)體制備、轉(zhuǎn)化中的酶濃度、甘露醇濃度、酶解時間、PEG 4000濃度及分離純化條件進行驗證...

【文章頁數(shù)】：72 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 落葉松基因組工程研究進展
        1.1.1 落葉松概述
        1.1.2 落葉松分子生物學(xué)進展
        1.1.3 落葉松基因組工程研究
    1.2 植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化進展
        1.2.1 原生質(zhì)體特性及轉(zhuǎn)化應(yīng)用
        1.2.2 原生質(zhì)體分離純化方法
        1.2.3 原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化方法
    1.3 植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件研究概況
        1.3.1 植物轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件分類
        1.3.2 植物啟動子元件主要類別及應(yīng)用
        1.3.3 植物啟動子元件分離及鑒定方法
    1.4 植物CRISPR-Cas9 基因組編輯系統(tǒng)
        1.4.1 CRISPR-Cas9 工作原理簡介
        1.4.2 CRISPR-Cas9 植物基因組編輯系統(tǒng)核心元件
    1.5 立題依據(jù)
    1.6 研究內(nèi)容
第二章 材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 工程菌株
    2.2 實驗試劑
    2.3 實驗儀器
    2.4 實驗方法
        2.4.1 落葉松胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
        2.4.2 落葉松原生質(zhì)體細胞計數(shù)及活性檢測
        2.4.3 落葉松原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化
        2.4.4 落葉松基因組DNA提取
        2.4.5 落葉松基因組及轉(zhuǎn)錄組通量測序
        2.4.6 落葉松候選啟動子元件分離及報告載體構(gòu)建
        2.4.7 落葉松CRISPR-Cas9 基因組編輯載體構(gòu)建
        2.4.8 水稻原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化
        2.4.9 水稻穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化
第三章 結(jié)果與分析
    3.1 落葉松原生質(zhì)體瞬時表達體系構(gòu)建
        3.1.1 落葉松愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)
        3.1.2 落葉松原生質(zhì)體分離制備關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
        3.1.3 落葉松原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化關(guān)鍵參數(shù)確定
        3.1.4 落葉松原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化方法
    3.2 落葉松啟動子元件挖掘及鑒定
        3.2.1 基于通量測序技術(shù)的落葉松高效候選啟動子挖掘
        3.2.2 落葉松候選啟動子關(guān)鍵元件分析
        3.2.3 落葉松候選啟動子分離鑒定
        3.2.4 落葉松候選啟動子轉(zhuǎn)錄活性比較分析
        3.2.5 落葉松啟動子在植物基因組工程中的應(yīng)用
    3.3 基于CRISPR-Cas9 的落葉松基因組編輯實現(xiàn)
        3.3.1 落葉松目標(biāo)基因序列確認(rèn)
        3.3.2 落葉松CRISPR-Cas9 向?qū)NA設(shè)計
        3.3.3 落葉松基因組編輯事件分析及確認(rèn)
第四章 討論
    4.1 落葉松原生質(zhì)體瞬時表達體系有效建立及優(yōu)化
    4.2 落葉松啟動子元件有效挖掘策略及應(yīng)用
    4.3 落葉松CRISPR-Cas9 基因組編輯體系建立及優(yōu)化
第五章 結(jié)論
致謝
參考文獻
攻碩期間取得的研究成果



本文編號：3744745