選題依據(jù):遠志Polygala tenuifolia是山西省道地藥材之一,且全國需求量較大。遠志皂苷是遠志發(fā)揮益智作用的主要活性成分,屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷,結(jié)構(gòu)復雜,單體化合物遠志皂苷價格昂貴,難以獲得,限制了該類成分的創(chuàng)新藥物研發(fā)。釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae在適宜的環(huán)境下生長較快,尤其是在大型液體發(fā)酵罐中極容易生長,其DNA基因序列已知,故容易進行基因編輯,而且酵母體內(nèi)具備合成萜類物質(zhì)所需的前體化合物（2,3-環(huán)氧角鯊烯）的能力,該能力使酵母在合成生物學研究中占有了相當大的優(yōu)勢。上述特點使通過改造S.cerevisiae進而實現(xiàn)萜類的異源生物合成成為可能。因此,為了提高遠志皂苷的產(chǎn)量,利用S.cerevisiae為底盤細胞進行萜類化合物的異源生物合成研究,是獲得遠志皂苷的新方法。天然產(chǎn)物的異源合成,為遠志皂苷的開發(fā)提供了新思路,具體為:通過研究遠志中合成遠志皂苷的具有催化功能的CYP450（cytochrome P450,CYP450）,利用酶切或者同源重組技術(shù)構(gòu)建基因表達盒或者目的片段,導入到具有表達基因的微生物細胞中,就能從微生物的代謝產(chǎn)物中獲... 

【文章頁數(shù)】：66 頁

【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
中文摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 立題背景及意義
    1.2 課題的研究內(nèi)容、技術(shù)路線圖及創(chuàng)新點
        1.2.1 研究內(nèi)容
        1.2.2 技術(shù)路線圖
        1.2.3 創(chuàng)新點
第二章 文獻綜述
    2.1 植物細胞色素P450 分類
    2.2 植物細胞色素P450 的功能
    2.3 CYP450 在實際中的應(yīng)用
    2.4 植物CYP88 家族功能研究進展
    2.5 植物 CYP88 族功能研究進展
第三章 CYP88A85 的生物信息學分析
    3.1 實驗方法
        3.1.1 CYP88A85 基因序列的獲得及生物信息學分析
        3.1.2 構(gòu)建CYP88A85 系統(tǒng)發(fā)育進化樹
    3.2 結(jié)果與分析
        3.2.1 遠志CYP88A85 基因序列分析
        3.2.2 遠志CYP88A85 蛋白序列分析
        3.2.3 CYP88A85 氨基酸序列特征區(qū)域分析
        3.2.4 CYP88A85 系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果
    3.3 討論
第四章 遠志CYP88A85 基因的時空表達
    4.1 研究材料
        4.1.1 供試植物
        4.1.2 主要試劑
        4.1.3 主要儀器
    4.2 研究方法
        4.2.1 引物的設(shè)計與合成
        4.2.2 CYP88A85 基因在不同年限遠志中的表達
        4.2.3 CYP88A85 基因在遠志的根、莖、葉、花中的mRNA表達
        4.2.4 數(shù)據(jù)處理
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 內(nèi)參基因的引物特異性驗證結(jié)果
        4.3.2 CYP88A85 基因在不同年限遠志及其不同組織中的mRNA表達分析
    4.4 討論
第五章 遠志CYP88A85 基因在釀酒酵母體內(nèi)的功能驗證
    5.1 研究材料
        5.1.1 菌株與質(zhì)粒
        5.1.2 主要試劑
        5.1.3 主要儀器
        5.1.4 培養(yǎng)基及常用溶液
    5.2 研究方法
        5.2.1 構(gòu)建CYP88A85與CPR表達載體
        5.2.2 雙酶切及連接反應(yīng)
        5.2.3 轉(zhuǎn)化、重組質(zhì)粒的表達
        5.2.4 酵母菌株構(gòu)建及搖瓶培養(yǎng)
        5.2.5 提取酵母代謝物
        5.2.6 檢測酵母代謝物
        5.2.7 繪制對照品標準曲線
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 PCR擴增、產(chǎn)物檢測及擴增產(chǎn)物回收純化
        5.3.2 遠志CYP88A85 基因重組表達載體的檢測
        5.3.3 釀酒酵母代謝物的檢測
    5.4 討論
第六章 總結(jié)與展望
    6.1 研究工作總結(jié)
    6.2 不足
    6.3 展望
縮寫詞表
參考文獻
攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文
致謝
個人簡況及聯(lián)系方式


【參考文獻】：
期刊論文
[1]小蒼蘭實時熒光定量PCR中的內(nèi)參基因篩選[J]. 丁蘇芹,李璽,唐東芹.  南京林業(yè)大學學報(自然科學版). 2020(03)
[2]栽培遠志qRT-PCR內(nèi)參基因篩選與P450s基因的時空表達分析[J]. 李娟,孔冉冉,梅月菊,張福生,田洪嶺,秦雪梅,杜晨暉,馬存根.  中草藥. 2019(24)
[3]細胞色素P450轉(zhuǎn)化代謝甾體類化合物研究進展[J]. 朱進倩,劉吉華.  藥物生物技術(shù). 2019(05)
[4]柴胡總皂苷調(diào)控細胞色素P450酶發(fā)揮類似柴胡疏肝散抗抑郁作用研究[J]. 賀澤慧,范榮,張春虎,唐濤,崔寒盡,劉胥,梁清華,王楊.  湖南中醫(yī)藥大學學報. 2019(06)
[5]輻射影響細胞色素P450的研究進展[J]. 辛元堯,年永瓊,李向陽.  藥學研究. 2019(05)
[6]細胞色素P450氧化還原酶在發(fā)育中的作用[J]. 戴永國,趙艷娟,汪暉,郭喻.  武漢大學學報(醫(yī)學版). 2019(03)
[7]細胞色素p450家族基因多態(tài)性與他莫昔芬臨床療效的關(guān)系[J]. 許馨元,蔡莉.  現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學. 2019(04)
[8]黃芩化學成分對人細胞色素P4501A的抑制作用研究[J]. 涂東珠,馬虹瑩,王亞喬,趙曉華,郭文治,葛廣波,楊凌.  中國中藥雜志. 2019(03)
[9]花生四烯酸細胞色素P450代謝物在腎臟生理和疾病中的作用（英文）[J]. 方琴,陳光志,王炎,汪道文.  生理學報. 2018(06)
[10]細胞色素P450在植物三萜和甾醇骨架修飾中的功能研究進展[J]. 楊杰,詹亞光,肖佳雷,尹靜.  中國科學:生命科學. 2018(10)

博士論文
[1]釀酒酵母中β-香樹脂醇合成途徑的構(gòu)建與調(diào)控[D]. 張根林.北京理工大學 2015
[2]甘草酸對CYP450酶的影響及其機制研究[D]. 涂江華.中南大學 2010

碩士論文
[1]利用基因同源重組技術(shù)構(gòu)建PtP450s的釀酒酵母在體功能研究體系[D]. 王倩玉.山西大學 2019
[2]遠志皂苷生物合成關(guān)鍵酶CYP716A249在釀酒酵母中的功能鑒定[D]. 蒲雅潔.山西大學 2018
[3]基于高通量轉(zhuǎn)錄組測序與植物代謝組學技術(shù)研究遠志皂苷生物合成途徑[D]. 李曉偉.山西大學 2014



本文編號：3708602