發(fā)布時(shí)間：2022-08-08 18:18

　　聯(lián)會(huì)復(fù)合中心組分蛋白1（Synaptonemal complex central element protein1,SYCE1）該基因是組成聯(lián)會(huì)復(fù)合體（Synaptonemal complex,SC）的主要成員,且對(duì)動(dòng)物生殖發(fā)育具有非常重要的影響。雄性動(dòng)物的生殖系統(tǒng)相對(duì)復(fù)雜,分泌激素、產(chǎn)生精子和成熟等功能主要由下丘腦-垂體-睪丸軸支撐,其次與各種參與的調(diào)節(jié)蛋白密切相關(guān)。本研究以雄性綿羊?yàn)檠芯繉?duì)象,通過(guò)RT-PCR克隆綿羊SYCE1基因序列并對(duì)序列進(jìn)行分析;利用qRT-PCR、Western blotting、免疫組化等技術(shù)分析SYCE1在綿羊下丘腦-垂體-睪丸生殖軸中及不同發(fā)育階段（40日齡、3月齡和12月齡）睪丸中的表達(dá)情況;以綿羊睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-SYCE1載體和siRNA-SYCE1載體進(jìn)行SYCE1基因的功能驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn):1、綿羊SYCE1該基因CDS全長(zhǎng)972 bp,為非跨膜可溶性不穩(wěn)定蛋白,編碼274個(gè)氨基酸殘基;SYCE1基因在不同種間進(jìn)化中高度保守。2、SYCE1在綿羊附睪（頭、體、尾）、睪丸、下丘腦和垂體各組織中mRNA和蛋白上均有表... 

【文章頁(yè)數(shù)】：68 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【文章目錄】：
縮略詞對(duì)照表
中文摘要
SUMMARY
第一章 文獻(xiàn)綜述
    1.1 綿羊的繁殖生理
    1.2 支持細(xì)胞研究進(jìn)展
        1.2.1 支持細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能
        1.2.2 支持細(xì)胞體外培養(yǎng)的意義
    1.3 減數(shù)分裂與聯(lián)會(huì)復(fù)合體研究進(jìn)展
    1.4 聯(lián)會(huì)復(fù)合體相關(guān)蛋白分類(lèi)及功能研究
    1.5 SYCE1研究進(jìn)展
        1.5.1 SYCE1在生殖領(lǐng)域的研究進(jìn)展
    1.6 siRNA技術(shù)的認(rèn)識(shí)
    1.7 研究的目的和意義
第二章 綿羊SYCE1基因克隆及序列分析
    2.1 材料與方法
        2.1.1 材料
    2.2 試劑與儀器
        2.2.1 試劑
        2.2.2 儀器
    2.3 方法
        2.3.1 提取綿羊睪丸組織Total RNA及 qPCR
            2.3.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成
        2.3.2 RT-PCR
        2.3.3 目的基因PCR擴(kuò)增
        2.3.4 目的片段回收與純化PCR產(chǎn)物
        2.3.5 SYCE1的載體連接、克隆及測(cè)序
            2.3.5.1 PCR產(chǎn)物連接pEASY-Blunt克隆載體
            2.3.5.2 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
            2.3.5.3 轉(zhuǎn)化菌的篩選與鑒定
        2.3.6 序列分析
            2.3.6.1 核苷酸和氨基酸序列分析[63]
    2.4 結(jié)果與分析
        2.4.1 綿羊SYCE1基因的克隆與序列分析
        2.4.2 綿羊SYCE1理化性質(zhì)分析
        2.4.3 SYCE1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析
        2.4.4 綿羊SYCE1氨基酸序列在不同種間的相似性分析
        2.4.5 SYCE1蛋白的保守性分析
    2.5 討論
    2.6 小結(jié)
第三章 綿羊SYCE1基因在雄性生殖軸系上的表達(dá)
    3.1 材料與方法
        3.1.1 材料
    3.2 試劑與儀器
        3.2.1 試劑
        3.2.2 儀器
    3.3 方法
        3.3.1 提取綿羊各個(gè)組織Total RNA及 qPCR
        3.3.2 qRT-PCR
            3.3.2.1 引物設(shè)計(jì)及合成
        3.3.3 免疫組化法
        3.3.4 總蛋白提取
    3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
    3.5 結(jié)果與分析
        3.5.1 雄性綿羊睪丸軸系中SYCE1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)
        3.5.2 Western Blotting驗(yàn)證SYCE1 蛋白在綿羊生殖軸的表達(dá)
        3.5.3 SYCE1陽(yáng)性細(xì)胞在雄性綿羊睪丸軸系的分布定位
    3.6 討論
    3.7 小結(jié)
第四章 SYCE1基因在綿羊不同年齡階段睪丸組織中的表達(dá)
    4.1 材料與方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 主要試劑
    4.2 方法
        4.2.1 不同發(fā)育階段綿羊睪丸RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄
        4.2.2 免疫組化和石蠟切片免疫熒光染色檢測(cè)SYCE1蛋白在不同年齡階段綿羊睪丸中的定位
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 qRT-PCR檢測(cè)SYCE1 mRNA在不同年齡階段綿羊睪丸中的表達(dá)
        4.3.2 Western Blotting檢測(cè)SYCE1 蛋白在不同年齡階綿羊睪丸中的表達(dá)
        4.3.3 SYCE1陽(yáng)性細(xì)胞在綿羊不同年齡階段睪丸組織中分布定位
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 SYCE1對(duì)綿羊原代培養(yǎng)分離睪丸支持細(xì)胞增殖的研究
    5.1 材料與方法
        5.1.1 樣品
        5.1.2 試劑與儀器
            5.1.2.1 試劑
            5.1.2.2 溶液
    5.2 綿羊睪丸分離支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化
        5.2.1 綿羊支持細(xì)胞的原代培養(yǎng)
        5.2.2 綿羊支持細(xì)胞的純化
    5.3 綿羊睪丸支持細(xì)胞的鑒定
        5.3.1 ABP免疫熒光染色
        5.3.2 綿羊支持細(xì)胞Feulgen染色
        5.3.3 綿羊支持細(xì)胞HE染色
    5.4 靶向SYCE1 基因siRNA合成及轉(zhuǎn)染
    5.5 靶向SYCE1 基因過(guò)表達(dá)載體PEGFP-C1-SYCE1 構(gòu)建、鑒定及轉(zhuǎn)染
        5.5.1 載體構(gòu)建基本信息
        5.5.2 RT-PCR擴(kuò)增目的基因SYCE1
            5.5.2.1 目的基因SYCE1(雙酶切位點(diǎn)XhoI和 SacII)
            5.5.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的切割及回收
        5.5.3 pEGFP-C1-SYCE1 載體構(gòu)建
            5.5.3.1 連接
            5.5.3.2 轉(zhuǎn)化及重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證
        5.5.4 pEGFP-C1-SYCE1 重組質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取
        5.5.5 轉(zhuǎn)染原代綿羊支持細(xì)胞
        5.5.6 CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖
        5.5.7 流式細(xì)胞檢測(cè)
    5.6 熒光定量檢測(cè)Cyclin D1和PCNA基因m RNA的表達(dá)
    5.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析
    5.8 結(jié)果和分析
        5.8.1 綿羊原代睪丸支持細(xì)胞的分離培養(yǎng)
        5.8.2 支持細(xì)胞的鑒定
        5.8.3 pEGFP-C1-SYCE1 過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建及檢測(cè)
        5.8.4 siRNA-SYCE1 的合成及沉默效果檢測(cè)
        5.8.5 細(xì)胞免疫熒光
        5.8.6 過(guò)表達(dá)SYCE1基因?qū)d羊原代支持細(xì)胞增殖的作用
            5.8.6.1 流式細(xì)胞檢測(cè)及CCK8檢測(cè)
        5.8.7 沉默SYCE1基因?qū)υС旨?xì)胞增殖的作用
            5.8.7.1 流式細(xì)胞檢測(cè)及CCK8檢測(cè)
        5.8.8 SYCE1基因過(guò)表達(dá)對(duì)支持細(xì)胞增殖基因的影響
        5.8.9 SYCE1基因沉默對(duì)支持細(xì)胞增殖基因的影響
    5.9 討論
    5.10 結(jié)論
第六章 全文總結(jié)
參考文獻(xiàn)
致謝
作者簡(jiǎn)介
在讀期間發(fā)表論文和研究成果等
導(dǎo)師簡(jiǎn)介


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]山羊睪丸支持細(xì)胞分離培養(yǎng)及其氧化應(yīng)激效果研究[J]. 王菊花,劉丹丹,劉琦,王佳明,董靜,周杰,薛秀恒.  中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2019(02)
[2]小鼠Nlrp基因家族生物信息學(xué)分析[J]. 羅榮松,馮郁,宋明民,左永春,李光鵬.  基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué). 2018(03)
[3]羊的繁殖配種技術(shù)[J]. 王云鋒.  黑龍江動(dòng)物繁殖. 2017(06)
[4]天祝白牦牛HSP60基因的克隆及其在下丘腦-垂體-睪丸中的表達(dá)定位研究[J]. 阮崇美,王相生,張勇,馬友記,胡俊杰,趙興緒.  核農(nóng)學(xué)報(bào). 2017(07)
[5]PDGFRA基因?qū)εＮ闯墒熘С旨?xì)胞體外增殖的影響[J]. 高一,秦立紅,房希碧,東雪,趙玉民,張國(guó)梁.  吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào). 2018(03)
[6]促性腺激素釋放激素拮抗劑在下丘腦垂體外生殖系統(tǒng)中的作用及臨床應(yīng)用[J]. 陳騫.  生殖醫(yī)學(xué)雜志. 2016(04)
[7]同期發(fā)情處理綿羊發(fā)情規(guī)律探討[J]. 包花拉,莫德日樂(lè)吐,王海軍,黃曉剛,閆俊,王建國(guó).  畜牧與飼料科學(xué). 2015(11)
[8]中國(guó)卵巢早衰婦女全基因組染色體拷貝數(shù)變異分析[J]. 甄秀梅,孫義民,喬杰,李蓉,王麗娜,劉平.  北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版). 2013(06)
[9]綿羊繁殖性狀相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]. 孟麗娜,張英杰,劉月琴.  中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué). 2012(S1)
[10]牛羊的生理生產(chǎn)指標(biāo)[J]. 陳曉霞.  養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn). 2009(06)

博士論文
[1]MTA2在睪丸支持細(xì)胞中的表達(dá)及功能研究[D]. 張順.第四軍醫(yī)大學(xué) 2013

碩士論文
[1]高原甘加藏羊發(fā)情周期下丘腦GnRH的動(dòng)態(tài)分泌及其受體在垂體和卵巢中表達(dá)[D]. 葛聞博.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018



本文編號(hào)：3671998