本文關(guān)鍵詞：山羊Tet蛋白家族主要組織表達(dá)檢測及其Tet3CDS區(qū)克隆和生物信息學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：DNA去甲基化在哺乳動(dòng)物早期胚胎發(fā)育和體細(xì)胞重編程過程中是必不可少的過程,而Tet蛋白家族在DNA去甲基化過程中發(fā)揮重要的作用。研究表明,Tet3蛋白是小鼠早期胚胎發(fā)育過程中雄原核主動(dòng)去甲基化的關(guān)鍵酶,也是胚胎發(fā)育所必需的蛋白因子。然而,不同物種的DNA去甲基化模式不同,并且山羊早期胚胎發(fā)育過程中Tet3蛋白的去甲基化機(jī)制尚不清楚,另外研究表明克隆胚胎普遍存在DNA去甲基化不完全的現(xiàn)象,這可能是導(dǎo)致克隆動(dòng)物效率低的一個(gè)原因。山羊Tet3蛋白能否提高克隆胚胎DNA甲基化重編程效率、降低甲基化異常概率,還不能確定�；诖�,本實(shí)驗(yàn)利用Real-Time PCR方法檢測山羊Tet蛋白家族基因各組織的相對(duì)表達(dá)量,通過Touchdown PCR方法從高表達(dá)Tet3的肝臟組織分三段擴(kuò)增Tet3 CDS區(qū),通過In-Fusion Cloning擴(kuò)增山羊Tet3CDS區(qū)全長,并構(gòu)建pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),通過ExPAsy、MEGA、Net Pho、NetNGlyc、SOPMA、SWISS-MODEL和STRING等生物信息學(xué)分析工具對(duì)山羊Tet3基因進(jìn)行分析及預(yù)測,為進(jìn)一步研究Tet3蛋白對(duì)山羊早期胚胎DNA甲基化重編程的作用提供理論參考和技術(shù)支持。本研究的主要內(nèi)容和結(jié)果如下:1.山羊Tet蛋白家族基因在各組織中的相對(duì)定量表達(dá)檢測采取3只山羊的12個(gè)組織,利用Trizol方法提取各組織Total RNA,通過RT-PCR得到cDNA。在NCBI上通過比對(duì)尋找山羊Tet蛋白家族各基因保守序列,設(shè)計(jì)定量引物。采用Real-Time PCR方法檢測山羊各組織中Tet蛋白家族基因的相對(duì)表達(dá)量,通過SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。根據(jù)Real-Time PCR,選取心臟組織為基準(zhǔn)樣品(1),利用相對(duì)定量2-ΔΔCт方法,結(jié)果表明山羊Tet1在皮膚(20.05)、脾臟(11.10)和卵巢(7.70)中相對(duì)表達(dá)量較高;山羊Tet2在脾臟(13.89)中相對(duì)表達(dá)量最高;山羊Tet3在脾臟(59.32)、胰腺(53.95)、肺臟(47.22)、卵巢(39.58)相對(duì)表達(dá)量較高。2.山羊Tet3 CDS區(qū)全長序列的分段擴(kuò)增及CDS全長序列的In-Fusion Cloning選取Tet3高表達(dá)的肺臟組織,提取Total RNA,通過RT-PCR得到cDNA。通過NCBI比對(duì)預(yù)測山羊Tet3 mRNA序列并根據(jù)此序列將包含Tet3 CDS全長的mRNA分三段設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增;采用Touchdown PCR并在PCR體系中添加二甲基亞砜來擴(kuò)增山羊高GC Tet3各片段,測序并拼接得到包含山羊Tet3 CDS區(qū)全長序列的Tet3 m RNA部分序列;用In-Fusion Cloning方法克隆全長4902 bp的山羊Tet3 CDS區(qū),雙酶切鑒定正確。3.山羊Tet3 pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體的構(gòu)建分別用Hind III和EcoR I雙酶切In-Fusion Cloning得到的帶有Tet3 CDS區(qū)的質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒,膠回收純化線性化載體和Tet3 CDS區(qū)目的片段,通過連接構(gòu)建pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體,經(jīng)酶切鑒定證明pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體構(gòu)建成功。4.山羊Tet3基因生物信息學(xué)分析利用ExPAsy、MEGA、NetPho、NetNGlyc、SOPMA、SWISS-MODEL和STRING等生物信息學(xué)分析工具分析山羊Tet3基因,分析結(jié)果表明:山羊Tet3和藏羚羊、牛、野牛的同源性大于97%,而同小鼠和人類的同源分別為85%及89%;山羊Tet3蛋白是一個(gè)由游離核糖體合成的、無信號(hào)肽、親水性、定位在細(xì)胞核內(nèi)具有去甲基化作用的Tet_JBP結(jié)構(gòu)功能域的蛋白。
【關(guān)鍵詞】：山羊 Tet3 Real-Time In-Fusion Cloning 生物信息學(xué)分析
【學(xué)位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：S827;Q78
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文獻(xiàn)綜述12-32
• 第一章 DNA甲基化和Tet蛋白的去甲基化12-32
• 1.1 哺乳動(dòng)物體細(xì)胞重編程的研究進(jìn)展12-19
• 1.1.1 體細(xì)胞重編程現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)12-13
• 1.1.2 體細(xì)胞重編程方法13-19
• 1.2 DNA甲基化和Tet蛋白的去甲基化19-27
• 1.2.1 DNA甲基化20-21
• 1.2.2 DNA去甲基化21-23
• 1.2.3 Tet蛋白家族23-27
• 1.3 無縫克隆27-32
• 1.3.1 無縫克隆的概述27-28
• 1.3.2 同源重組28-29
• 1.3.3 無縫克隆的實(shí)驗(yàn)方法29-32
• 實(shí)驗(yàn)研究32-70
• 第二章 山羊Tet蛋白家族基因在主要組織中的相對(duì)定量表達(dá)檢測32-50
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料32-34
• 2.1.1 組織樣品、感受態(tài)細(xì)菌、載體來源32-33
• 2.1.2 儀器設(shè)備33
• 2.1.3 主要試劑及配置33-34
• 2.2 試驗(yàn)方法34-41
• 2.2.1 山羊各組織的采取34-35
• 2.2.2 山羊各組織Total RNA的提取35
• 2.2.3 山羊各組織Total RNA第一鏈cDNA的合成35-36
• 2.2.4 山羊Tet蛋白家族定量引物設(shè)計(jì)36-37
• 2.2.5 山羊GAPDH及山羊Tet蛋白家族基因定量引物的驗(yàn)證37-40
• 2.2.6 山羊Tet蛋白家族基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR(Real-Time PCR)40-41
• 2.3 結(jié)果41-48
• 2.3.1 山羊各組織Total RNA純度和濃度檢測結(jié)果41-42
• 2.3.2 山羊各組織Total RNA第一鏈cDNA合成質(zhì)量檢測結(jié)果42-43
• 2.3.3 山羊Tet蛋白家族基因定量引物檢測結(jié)果43
• 2.3.4 山羊Tet蛋白家族基因定量引物PCR擴(kuò)增序列測序比對(duì)結(jié)果43-45
• 2.3.5 山羊Tet蛋白家族Real-Time PCR結(jié)果及分析45-48
• 2.4 討論48-49
• 2.5 小結(jié)49-50
• 第三章 In-Fusion Cloning擴(kuò)增高GC山羊Tet3 CDS全長及其生物信息學(xué)分析50-70
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料50-51
• 3.1.1 pUC19載體、感受態(tài)細(xì)菌、山羊肺臟組織來源50
• 3.1.2 試劑50-51
• 3.1.3 儀器設(shè)備51
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法51-57
• 3.2.1 山羊Tet3 mRNA和CDS序列的預(yù)測51
• 3.2.2 山羊肺臟組織Total RNA提取和反轉(zhuǎn)錄第一鏈c DNA的合成51-52
• 3.2.3 山羊Tet3 CDS全長序列的Touchdown PCR法分段擴(kuò)增52-54
• 3.2.4 In-Fusion Cloning擴(kuò)增山羊Tet3 CDS全長序列54-56
• 3.2.5 pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體的構(gòu)建56
• 3.2.6 山羊Tet3生物信息學(xué)分析56-57
• 3.3 結(jié)果57-67
• 3.3.1 預(yù)測得到山羊Tet3 mRNA和CDS序列57
• 3.3.2 利用Touchdown PCR擴(kuò)增山羊Tet3 mRNA 3 段分段產(chǎn)物57-58
• 3.3.3 In-Fusion Cloning擴(kuò)增山羊Tet3 CDS全長序列鑒定結(jié)果58-59
• 3.3.4 pEGFP-N1-Tet3表達(dá)載體雙酶切鑒定結(jié)果59-60
• 3.3.5 山羊Tet3蛋白生物信息學(xué)預(yù)測60-67
• 3.4 討論67-68
• 3.5 小結(jié)68-70
• 全文結(jié)論70-71
• 參考文獻(xiàn)71-79
• 致謝79-80
• 作者簡介80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 吳畏;徐海偉;屈婭;陰正勤;;細(xì)胞融合致體細(xì)胞重編程機(jī)制研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2012年04期

  本文關(guān)鍵詞：山羊Tet蛋白家族主要組織表達(dá)檢測及其Tet3CDS區(qū)克隆和生物信息學(xué)分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：363353