甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）是我國重要的蔬菜作物,也是世界各國廣泛種植的葉用類蔬菜作物之一。我國每年栽培面積可達(dá)90萬hm²,在蔬菜周年均衡供應(yīng)中占有重要地位。甘藍(lán)是典型的異花授粉植物且具有顯著的雜種優(yōu)勢特點(diǎn),育種家主要通過自交不親和系配制雜種一代,但自交不親和的特點(diǎn)使其繁殖需要蕾期人工授粉,不僅效率低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成本高,而且會因自交不親和造成結(jié)實(shí)率低產(chǎn)量少的問題,以上因素都嚴(yán)重制約了育種人員對甘藍(lán)農(nóng)藝性狀的改良進(jìn)程。近年來,CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9）系統(tǒng)得到了廣泛應(yīng)用,其作為一種新的基因編輯工具,具有操作簡單、成本低、周期短的優(yōu)點(diǎn),在定向改造植物基因組上表現(xiàn)出了巨大的潛力。目前已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了在水稻、小麥、擬南芥、煙草等植物中的基因定點(diǎn)編輯,近兩年CRISPR系統(tǒng)在甘藍(lán)上也得到了成功應(yīng)用,但尚不成熟。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除甘藍(lán)八氫番茄紅素脫氫酶BoPDS基因、SRK基因,以期獲得基因編輯的甘藍(lán)植株,為建立... 

【文章來源】：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省

【文章頁數(shù)】：65 頁

【學(xué)位級別】：碩士

【部分圖文】：

CRISPR-Cas結(jié)構(gòu)

利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建甘藍(lán)BoPDS和SRK15基因敲除載體及遺傳轉(zhuǎn)化5列）和Cas基因[39]。CRISPR序列由間隔序列（spacer）和許多保守的重復(fù)序列（repeat）間隔串聯(lián)構(gòu)成（圖1-1），重復(fù)序列的長度由23個(gè)堿基到50個(gè)堿基不等，具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和回文結(jié)構(gòu)，間隔序列大多數(shù)來源于入侵的病毒和噬菌體，它的作用是將重復(fù)序列分開，間隔序列的數(shù)量因物種的不同而異；Cas基因家族位于CRISPR序列附近，其具有核酸酶的切割功能并且可以和DNA或者RNA結(jié)合，同時(shí)能夠編碼Cas蛋白，用于抵抗外源遺傳物質(zhì)的入侵，crRNA引導(dǎo)Cas蛋白共同參與抵抗外源遺傳物質(zhì)的過程[40]。2011年，Makarova等根據(jù)Cas蛋白序列的保守性、組成及在免疫防御過程中對外來遺傳物質(zhì)不一樣的應(yīng)對方式，將CRISPR系統(tǒng)分成I型、II型和III型共三種不同類型[41]，I型和III型系統(tǒng)切割DNA序列時(shí)需要多種Cas蛋白一起參與，該過程較為繁瑣復(fù)雜，II型系統(tǒng)只要求一種Cas9蛋白參與反應(yīng)即可，組分較為簡單，因此，研究者對II型CRISPR系統(tǒng)的認(rèn)識最為深入，目前應(yīng)用最廣泛的CRISPR/Cas9技術(shù)就屬于II型CRISPR系統(tǒng)，它的作用原理是：當(dāng)外源DNA進(jìn)入細(xì)菌時(shí)，前導(dǎo)區(qū)(Leader)就會調(diào)控CRISPR序列轉(zhuǎn)錄出pre-crRNA和trans-actingcrRNA(tracrRNA)，隨后兩者經(jīng)過加工形成成熟的crRNA，然后crRNA、tracrRNA和Cas9蛋白形成復(fù)合體，這個(gè)復(fù)合體能夠識別和切割含有PAM的外源DNA序列，最終導(dǎo)致外源DNA表達(dá)沉默（圖1-2）。圖1-1CRISPR-Cas結(jié)構(gòu)Fig.1-1ThestructureofCRISPR-Cas圖1-2CRISPR/Cas9系統(tǒng)作用機(jī)制[92]Fig.1-2MechanismofCRISPR/Cas9system

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)2020屆碩士學(xué)位論文12靶向能力。最后，我們利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)定點(diǎn)敲除甘藍(lán)BoPDS基因和SRK基因，將分別修飾兩個(gè)靶位點(diǎn)的PBSE401-BoPDS-CRISPR表達(dá)載體和PKSE401-SRK15-CRISPR表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法侵染甘藍(lán)子葉，對甘藍(lán)BoPDS基因和SRK基因進(jìn)行編輯，以期獲得具有目標(biāo)性狀的基因編輯植株。2.3技術(shù)路線圖2-1技術(shù)路線圖Fig.2-1Technologyroadmap

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻植酸合成酶IPK1基因[J]. 李青慧,王麗娜,鄭穎媚,孫艷香,陳喜文,陳德富.  南開大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2019(06)
[2]CRISPR/Cas9技術(shù)及其在水稻和小麥遺傳改良中的應(yīng)用綜述[J]. 馬斯霜,白海波,惠建,呂學(xué)蓮,陳曉軍,李樹華.  江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué). 2019(20)
[3]小麥淀粉分支酶CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)gRNA表達(dá)載體構(gòu)建[J]. 李苗,陳曉軍,馬斯霜,白海波,鄭國保,朱金霞,張?jiān)磁?  分子植物育種. 2019(20)
[4]CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 陳楠楠.  生物化工. 2019(05)
[5]CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因組編輯技術(shù)在農(nóng)作物基因功能中的研究進(jìn)展[J]. 聶利珍,房永雨.  北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2019(04)
[6]CRISPR/Cas9介導(dǎo)煙草多基因編輯體系的應(yīng)用[J]. 謝小東,高軍平,李澤鋒,張劍鋒,魏攀,羅朝鵬,王晨,武明珠,翟妞,楊軍.  中國煙草學(xué)報(bào). 2019(04)
[7]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除水稻NRR基因促進(jìn)根系生長的研究[J]. 王海明,張立強(qiáng),李娜,劉建豐,馬崇烈.  雜交水稻. 2019(05)
[8]一種擬南芥基因高效編輯體系研究[J]. 歐陽樂軍,馬銘賽,陳梓洛,黃嘉玲,布梁灝,陳自銀,李莉梅.  植物研究. 2019(06)
[9]利用CRISPR/Cas9技術(shù)編輯水稻負(fù)調(diào)控抗病基因OsEDR1及基因功能分析[J]. 武廣珩,傅仙玉.  應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào). 2019(06)
[10]CRISPR-Cas9系統(tǒng)在蔬菜育種上應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 暴會會,尹竹君,王少坤,馬瑞紅,謝俊俊,張杰,楊正安.  江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào). 2019(07)

碩士論文
[1]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建葡萄基因敲除載體及遺傳轉(zhuǎn)化[D]. 劉月娥.西北農(nóng)林科技大學(xué) 2019
[2]利用CRISPR/Cas9技術(shù)創(chuàng)制矮生黃瓜株系[D]. 戚晶晶.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2017
[3]利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)敲除楊樹和煙草PDS基因的研究[D]. 李媛.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 2016
[4]甘藍(lán)型油菜及近緣親本春化基因VIN3的克隆與進(jìn)化分析[D]. 羅潔.華中科技大學(xué) 2013



本文編號：3626856