本文關(guān)鍵詞：棉花逆境響應(yīng)相關(guān)NAC類轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：干旱、鹽、病害等逆境脅迫嚴重影響著植物正常的生長發(fā)育,進而制約著作物產(chǎn)量。植物在漫長的進化過程中,通過感知逆境信號,調(diào)控抵御逆境的相關(guān)基因表達變化,形成了諸多在逆境脅迫下的保護機制。NAC轉(zhuǎn)錄因子為植物所特有,目前對擬南芥、水稻等植物NAC基因的研究表明,NAC基因在植物生長發(fā)育,器官形成,植株衰老,激素信號傳導及逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。目的:在亞洲棉全基因組中預測分析NAC基因,進一步開發(fā)棉花NAC基因資源;克隆獲得陸地棉NAC轉(zhuǎn)錄因子,研究其在干旱、鹽、病害等逆境脅迫下的表達,分析其轉(zhuǎn)錄活性,為揭示棉花NAC轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)逆境脅迫中的作用奠定基礎(chǔ)方法:利用生物信息學方法預測亞洲棉全基因組的NAC基因;采用RT-PCR方法克隆Gh SNAC5和Gh SNAC8基因;采用實時熒光定量PCR技術(shù)分析基因在干旱、鹽、病害等逆境脅迫下的表達;通過構(gòu)建酵母轉(zhuǎn)錄激活載體和亞細胞定位載體分析基因的轉(zhuǎn)錄因子活性;采用基因工程方法構(gòu)建Gh SNAC5和Gh SNAC8基因的植物表達載體;通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草。結(jié)果:在亞洲棉全基因組中預測了138個NAC基因,根據(jù)Ga NAC蛋白的序列相似性及系統(tǒng)進化分析,將其分為11個亞家族,每個亞家族的Ga NAC蛋白數(shù)目為4-25個。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),63.7%的Ga NAC基因含有2個內(nèi)含子。Gh SNAC5基因的c DNA序列長度為1080bp,其開放閱讀框(ORF)編碼299個氨基酸。Gh SNAC8基因的c DNA序列長度為1104bp,其開放閱讀框(ORF)編碼349個氨基酸。2個基因所編碼的蛋白序列在N-末端均含有NAM保守域。對基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Gh SNAC5和Gh SNAC8基因分別各含有3個外顯子2個內(nèi)含子,且內(nèi)含子具有典型的植物內(nèi)含子特征。利用熒光實時定量PCR分析了Gh SNAC5和Gh SNAC8基因受高鹽、干旱及黃萎病脅迫處理后的表達變化。結(jié)果顯示,Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到干旱處理2h后,表達明顯上調(diào),24h后呈現(xiàn)下降態(tài)勢;Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到高鹽處理2h后,表達量明顯上調(diào)。Gh SNAC5基因在高鹽脅迫12h后,相對表達量上調(diào)了50倍,這說明Gh SNAC5基因在響應(yīng)鹽脅迫時,具有高表達性。Gh SNAC5和Gh SNAC8基因在受到黃萎病VD8處理6h后,相對表達量明顯上升,比受干旱及鹽處理的響應(yīng)時間要延后。通過構(gòu)建酵母轉(zhuǎn)錄激活載體對Gh SNAC5和Gh SNAC8基因的轉(zhuǎn)錄激活活性進行了試驗,缺失培養(yǎng)生長情況及β-gal顯色結(jié)果顯示,Gh SNAC5和Gh SNAC8基因均能轉(zhuǎn)錄激活下游基因的表達。利用p BI221-GFP載體將Gh SNAC5和Gh SNAC8與GFP構(gòu)建融合蛋白,瞬時表達試驗結(jié)果顯示,Gh SNAC5和Gh SNAC8均定位與細胞核內(nèi)。利用p CAMBIA3301及p ROKⅡ構(gòu)建了一個新載體,與Gh SNAC5和Gh SNAC8基因重組構(gòu)建了植物過表達載體,并成功轉(zhuǎn)化至煙草。結(jié)論:通過比較亞洲棉與陸地棉、雷蒙德氏棉NAC蛋白的同源性,發(fā)現(xiàn)亞洲棉與雷蒙德氏棉NAC蛋白的匹配程度高于陸地棉,為亞洲棉及陸地棉NAC轉(zhuǎn)錄因子的后續(xù)深入研究提供了重要參考。本研究從陸地棉中克隆并分析了兩個NAC基因Gh SNAC5和Gh SNAC8,為Gh SNAC5和Gh SNAC8基因功能的深入研究奠定基礎(chǔ),并為棉花的遺傳改良提供了基因資源;
【關(guān)鍵詞】：棉花 NAC轉(zhuǎn)錄因子 克隆 表達 逆境脅迫
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S562;Q943.2
【目錄】：

• 摘要5-6
• Abstract6-9
• 符號說明9-10
• 第一章 文獻綜述10-17
• 1.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進展10-14
• 1.1.1 NAC轉(zhuǎn)錄因子的發(fā)現(xiàn)10-11
• 1.1.2 NAC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點11
• 1.1.3 NAC轉(zhuǎn)錄因子的作用機制11-12
• 1.1.4 NAC基因的調(diào)控機制12
• 1.1.5 NAC轉(zhuǎn)錄因子的功能研究進展12-14
• 1.2 棉花NAC轉(zhuǎn)錄因子的研究進展14-15
• 1.2.1 雷蒙德氏棉和亞洲棉NAC轉(zhuǎn)錄因子研究14-15
• 1.2.2 陸地棉NAC轉(zhuǎn)錄因子研究15
• 1.3 研究意義15-17
• 第二章 亞洲棉全基因組NAC基因的預測及分析17-31
• 2.1 試驗材料17
• 2.1.1 序列17
• 2.1.2 主要生物軟件及網(wǎng)站17
• 2.2 試驗方法17-18
• 2.2.1 亞洲棉NAC基因的鑒定17-18
• 2.2.2 亞洲棉NAC基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建18
• 2.2.3 miR164靶序列的預測18
• 2.3 試驗結(jié)果18-29
• 2.3.1 亞洲棉NAC基因的鑒定18-20
• 2.3.2 亞洲棉GaNAC基因結(jié)構(gòu)的分析20-25
• 2.3.3 亞洲棉GaNAC蛋白的系統(tǒng)進化分析25-26
• 2.3.4 miR164靶基因的分析26-27
• 2.3.5 GhSNAC5和GhSNAC8基因與138個GaNACs及78個GhNACs的比對27-29
• 2.4 本章討論29-31
• 第三章 棉花GhSNAC5和GhSNAC8基因的克隆及生物信息學分析31-40
• 3.1 試驗材料31-32
• 3.1.1 植物材料與菌株31
• 3.1.2 酶與試劑盒31
• 3.1.3 培養(yǎng)基與試劑31-32
• 3.1.4 主要儀器設(shè)備32
• 3.1.5 引物序列32
• 3.2 試驗方法32-36
• 3.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄32-33
• 3.2.2 DNA提取33-34
• 3.2.3 目的基因的克隆34-35
• 3.2.4 GhSNAC5和GhSNAC8基因生物生物信息學分析35-36
• 3.3 試驗結(jié)果36-38
• 3.3.1 GhSNAC5和GhSNAC8基因的獲得36-37
• 3.3.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因的生物信息學分析37-38
• 3.4 本章討論38-40
• 第四章 GhSNAC5和GhSNAC8基因的轉(zhuǎn)錄因子性質(zhì)分析40-53
• 4.1 試驗材料40-42
• 4.1.1 菌株和質(zhì)粒載體40
• 4.1.2 酶及試驗藥品40
• 4.1.3 培養(yǎng)基40-41
• 4.1.4 常用試劑41
• 4.1.5 引物序列41-42
• 4.2 試驗方法42-47
• 4.2.1 GhSNAC5和GhSNAC8轉(zhuǎn)錄激活試驗42-44
• 4.2.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因亞細胞定位44-47
• 4.3 試驗結(jié)果47-52
• 4.3.1 GhSNAC5和GhSNAC8基因轉(zhuǎn)錄激活活性分析47-50
• 4.3.2 GhSNAC5和GhSNAC8基因亞細胞定位試驗50-52
• 4.4 本章討論52-53
• 第五章 GhSNAC5和GhSNAC8基因的表達分析53-57
• 5.1 試驗材料53
• 5.1.1 試驗材料53
• 5.1.2 藥品及試劑盒53
• 5.1.3 引物53
• 5.2 試驗方法53-54
• 5.2.1 棉花處理53-54
• 5.2.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄54
• 5.2.3 實時熒光定量PCR54
• 5.3 試驗結(jié)果54-56
• 5.3.1 黃萎病VD8侵染棉花幼苗的表型變化54-55
• 5.3.2 GhSNAC5基因的表達量變化55
• 5.3.3 GhSNAC8基因的表達量變化55-56
• 5.4 本章討論56-57
• 第六章 植物過表達載體的構(gòu)建及煙草轉(zhuǎn)化57-68
• 6.1 試驗材料57-59
• 6.1.1 植物、菌株及載體57
• 6.1.2 培養(yǎng)基57-58
• 6.1.3 引物序列58-59
• 6.2 試驗方法59-62
• 6.2.1 pCAMBIA3301及pROKⅡ構(gòu)建成一個新載體pCAMBIA3301new59
• 6.2.2 植物過表達載體的構(gòu)建59-60
• 6.2.3 重組植物過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌60-61
• 6.2.4 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草61-62
• 6.2.5 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定62
• 6.3 試驗結(jié)果62-66
• 6.3.1 pCAMBIA3301及pROKⅡ構(gòu)建成一個新載體62-63
• 6.3.2 植物過表達載體的構(gòu)建63-65
• 6.3.3 葉盤法轉(zhuǎn)化煙草65-66
• 6.3.4 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定66
• 6.4 本章討論66-68
• 第七章 結(jié)論及展望68-69
• 7.1 結(jié)論68
• 7.2 展望68-69
• 參考文獻69-74
• 附錄74-77
• 致謝77-78
• 作者簡介78-79
• 附件79

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 邵鳳霞;柳展基;魏麗奇;曹敏;畢玉平;;花生NAC類新基因AhNAC1的克隆及序列分析[J];西北植物學報;2008年10期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 盧敏;玉米ZmSNAC1和高粱SbSNAC1基因的克隆與功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2013年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 邵鳳霞;花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能分析[D];山東師范大學;2009年

2 趙鳳利;棉花葉片衰老相關(guān)基因GhNAC12的功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2014年

  本文關(guān)鍵詞：棉花逆境響應(yīng)相關(guān)NAC類轉(zhuǎn)錄因子的克隆與分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

，

本文編號：361639