生長(zhǎng)激素（growthhormone,GH）是在腺垂體中合成的一種蛋白質(zhì)類(lèi)激素,幾乎能作用于所有的組織,調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝并具有脂解作用。當(dāng)生長(zhǎng)激素分泌過(guò)多時(shí),會(huì)引起巨人癥和肢端肥大癥;當(dāng)生長(zhǎng)激素分泌過(guò)少時(shí),將導(dǎo)致侏儒癥。所以將GH保持在穩(wěn)定且合適的水平以維持生理穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。GH的生成主要受生長(zhǎng)激素釋放激素（growth hormone regulating hormone,GHRH）和生長(zhǎng)激素釋放抑制激素（growth hormone release-inlease-inhibiting hormone,GHRIH）這兩種激素調(diào)控。除了這兩個(gè)經(jīng)典的調(diào)節(jié)因子外,各種神經(jīng)遞質(zhì)、激素或細(xì)胞因子在GH分泌中也起作用。因此,明確參與GH調(diào)節(jié)的分子機(jī)制至關(guān)重要。circular RNA（circRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性長(zhǎng)鏈非編碼RNA,目前已有大量研究證明circRNA在不同的物種和細(xì)胞系中具有不同生物學(xué)功能,其中被研究最多的是circRNA具有ceRNA的功能,可以通過(guò)miRNA反應(yīng)原件（MRE）與大量miRNA相結(jié)合并影響miRNA對(duì)其靶基因的結(jié)合能力,進(jìn)而負(fù)性調(diào)節(jié)該miRNA的生物學(xué)功... 

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圖２．３?ｃｅＲＮＡ網(wǎng)絡(luò)―??Ｆｉｇ．２．３?ｃｅＲＮＡ?ｎｅｔｗｏｒｋ１１？??２．２．３．２與ＲＮＡ結(jié)合蛋白相互作用??ｃｉｒｃＲＮＡ還可以通過(guò)與ＲＮＡ結(jié)合蛋白相互作用在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)??

第工篇研＿究?jī)?nèi)容：第一章?ｍｉＲ－５４＿３－５ｐ的差異表達(dá)在大＿鼠腺垂體細(xì)Ｊｆｅ中對(duì)ＧＨ的調(diào)控作用??序列片段克隆至載體中，載體圖譜如圖１．１：??Ｊｒ?ｐｍｉＲ－ＲＢ－ＲＥＰＯＲＴ＊?＼??ｈｓｖ－ｔｋ?ｖｅｃｔｏｒ?丄??ｐｒｏｍｏｔｅｒ?＿＿＿＿?ｖｃｕｌｕｊ．?■??Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??７＾ｒ＾＾Ｐ〇＿?ＭｓＶ４０?ｅａｒｌｙ??Ｐｍｅｌ?ｆ＼?＼?ｅｎｈａｎｃｅｒ／??Ｘｈｏｌ?／?＼?＼?ｐｒｏｍｏｔｅｒ??ｓ９ｆｌ?／??圖１．１酶切載體示意圖??Ｆｉｇｌ．ｌ?Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｅｎｚｙｍｅ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｖｅｃｔｏｒ??（２）基因合成：通過(guò)全基因合成的方法獲得野生型的模板ａ??（３）?酶切：用Ｘｈｏｌ，Ｎｏｔｌ對(duì)野生駕的模板以及載體進(jìn)行雙酶切，酶切反??應(yīng)體系如下：ｌ〇ｘＨ緩沖液４０，ＤＮＡ約２昭，內(nèi)切酶（ｌＯＵ／ｐｌ）各１此補(bǔ)充滅菌??去離子水使總體系至４００。３７°Ｃ條件下反應(yīng)４小時(shí)。??（４）酶切＿收純化：在酶切之后０收酶切產(chǎn)物，根據(jù)說(shuō)明書(shū)純化產(chǎn)物。??（５）連接：＿的．片段?ＤＮＡ２（ｉｌ（約?ｌ５〇ｎｇ），載體?０．５［ｉｌ（約?５〇ｎｇ），ｓｏｌｕｔｉｏｎ??Ｉ快速連接液５汕補(bǔ)充滅菌去離子水至總體系為１０?ｐｉ，１６°Ｃ連接３０分鐘。??（６）轉(zhuǎn)化：??１、?將連接產(chǎn)物與１０００?ＤＨ５ａ感受態(tài)細(xì)胞充分混勻后置于冰上孵育??３０ｍｉｎ〇??２、?孵育后將轉(zhuǎn)化液置于４２°Ｃ水浴鍋中水浴９０秒，再馬上取出，并繼續(xù)置??于冰上孵育３ｍｉｎ。??２３??

ｐＭ?各?０．５?ｐｉ，?Ｔａｑ?ＤＮＡ?聚合酶??Ｃ２．５Ｕ４ｉｌ）?０．３ｐｌ，ＤＮＡ模板０．５…，補(bǔ)充無(wú)菌水至總體系為Ｉ。－。反應(yīng)條件為??預(yù)變性９５°Ｃ?３分鐘，循環(huán)內(nèi)９５°Ｃ?３０秒變性，５６°Ｃ退火，７２°Ｃ延伸１分鐘；２０??個(gè)循環(huán)；ＰＣＲ反應(yīng)循環(huán)后７２°Ｃ繼續(xù)延伸３分鐘，然后４°Ｃ保存６??實(shí)驗(yàn)挑起了上述平板上的共五處單菌落進(jìn)行ＰＣＲ，�。担穑�?ＰＣＲ產(chǎn)物進(jìn)行１．５％??瓊脂糖電泳分析，根據(jù)所設(shè)計(jì)的引物而擴(kuò)増的條帶片段理論大小應(yīng)在３００ｂｐ左??右，瓊脂糖凝膠電泳圖如圖１．２：??Ｍ??２５０ｂｐ—＾＿＿３〇〇ｂｐ??ｒ－Ｇｈｌ－ＷＴ??圖１．２聯(lián)合載體擴(kuò)增后ＰＣＲ??Ｆｉｇ．?１．２?ＰＣＲ?ｏｆ?ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ－ｖｅｃｔｏｒｓ??１．２．８雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)??（１）?３７°Ｃ，５％的Ｃ０２培養(yǎng)箱中培養(yǎng)２９３Ｔ細(xì)胞。??２４??


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