己糖激酶（HXK;EC2.7.1.1）同工酶廣泛參與植物營養(yǎng)代謝,尤其在水稻根部銨同化相關碳代謝調(diào)節(jié)上具有重要功能。本研究以水稻9311 （Oryza sativa L. cv indica9311）和珞優(yōu)8號（Oryza sativa L. cv Luoyou8）為材料,營養(yǎng)液中加入3 mM的α-酮戊二酸或90 mM蔗糖,處理48 h,水稻根部谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase; GS）和谷氨酸合酶（NADH-dependent glutamate synthase; NADH-GOGAT）活性升高,營養(yǎng)液銨離子吸收速率加快。證明α-酮戊二酸或蔗糖處理可促進水稻根部銨同化。活性染色結(jié)合熒光定量PCR分析表明α-酮戊二酸提高了根部HXK同工酶活性及其mRNA豐度。說明水稻HXK同工酶是α-酮戊二酸調(diào)節(jié)水稻根部銨同化的靶標酶。提取水稻9311根部總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA,以此為模板PCR擴增OsHXK6全長片段,PCR產(chǎn)物插入pMD18-T并測序。生物信息學分析表明OsHXK6為單次跨膜蛋白,N端27個氨基酸殘基構(gòu)成跨膜區(qū),截去跨膜區(qū)后,預測蛋白質(zhì)相對分子... 

【文章來源】：華中師范大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：碩士

【文章目錄】：
摘要
Abstract
第一章 文獻綜述
    1.1 己糖激酶生物化學功能
    1.2 植物己糖激酶家族
        1.2.1 己糖激酶
        1.2.2 葡萄糖激酶
        1.2.3 果糖激酶
    1.3 植物己糖激酶與代謝調(diào)控
        1.3.1 植物己糖激酶與糖信號
        1.3.2 植物己糖激酶參與氮同化調(diào)控
    1.4 植物己糖激酶基因研究現(xiàn)狀
        1.4.1 高等植物己糖激酶同源基因的分離
        1.4.2 高等植物己糖激酶同源基因的結(jié)構(gòu)
        1.4.3 高等植物己糖激酶亞細胞定位
        1.4.4 高等植物己糖激酶同源基因的表達
    1.5 蛋白表達系統(tǒng)
        1.5.1 大腸桿菌表達系統(tǒng)
        1.5.2 酵母表達系統(tǒng)
    1.6 植物己糖激酶生物化學特性
        1.6.1 植物己糖激酶催化特性
        1.6.2 酶抑制劑動力學
        1.6.3 酶穩(wěn)定性
        1.6.4 植物己糖激酶結(jié)構(gòu)生物學
    1.7 本研究主要內(nèi)容和意義
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗材料
        2.1.1 水稻種子和工程菌來源
        2.1.2 主要試劑與器材
        2.1.3 主要培養(yǎng)基
        2.1.4 PCR擴增引物
        2.1.5 主要溶液和常用緩沖液
    2.2 實驗方法
        2.2.1 水稻培養(yǎng)
        2.2.2 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成
        2.2.3 熒光定量PCR檢測OsHX和OsGlnB轉(zhuǎn)錄量
        2.2.4 植物銨同化相關C/N代謝酶活性測定
        2.2.5 植物組織離子濃度測定
        2.2.6 HXK同工酶活性染色
        2.2.7 OsHXK6基因克隆與重組表達質(zhì)粒構(gòu)建
        2.2.8 OsHXK6原核表達
        2.2.9 OsHXK6真核表達
第三章 實驗結(jié)果
    3.1 OsHXK5和OsHXK6參與銨同化調(diào)節(jié)
        3.1.1 α-酮戊二酸調(diào)節(jié)水稻根部銨同化
        3.1.2 α-酮戊二酸調(diào)節(jié)己糖激酶同工酶活性
    3.2 OsHXK6基因克隆與序列分析
        3.2.1 水稻根總RNA提取和總cDNA第一鏈合成
        3.2.2 OsHXK6基因PCR擴增
        3.2.3 OsHXK6基因序列分析
    3.3 重組蛋白OsHXK6-27AA原核表達
        3.3.1 重組表達質(zhì)粒pET-HXK6-27AA構(gòu)建
        3.3.2 重組蛋白OsHXK6-27AA原核表達SDS-PAGE分析
    3.4 原核表達重組蛋白OsHXK6-27AA催化特性
        3.4.1 重組蛋白OsHXK6-27AA最適反應條件
        3.4.2 重組蛋白OsHXK6-27AA催化活性和抑制劑分析
        3.4.3 重組蛋白OsHXK6-27AA熱穩(wěn)定性和金屬離子對酶活性影響
    3.5 重組蛋白OsHXK6-27AA真核表達
        3.5.1 OsHXK6-27AA酵母重組表達質(zhì)粒構(gòu)建
        3.5.2 OsHXK6-27AA酵母陽性重組子篩選
        3.5.3 重組蛋白OsHXK6-27AA真核表達SDS-PAGE分析
    3.6 酵母表達重組蛋白OsHXK6-27AA催化活性和抑制劑分析
第四章 討論
參考文獻
碩士期間發(fā)表/待發(fā)表論文
衷也感謝下基金資助
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
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[4]大腸桿菌表達系統(tǒng)的研究進展[J]. 戎晶晶,刁振宇,周國華.  藥物生物技術. 2005(06)
[5]酶穩(wěn)定性的研究進展[J]. 徐金庫,張媛媛,劉均洪.  化學與生物工程. 2004(03)
[6]NaCl對水稻谷氨酸合酶和谷氨酸脫氫酶的脅迫作用[J]. 林清華,李常健,彭進,張楚富,Peng Shaobing,Bennett John.  武漢植物學研究. 2000(03)



本文編號：3603351